AiiA蛋白的表達和生物活性檢測.pdf

1、aiiA (N-acyl-homoserine lactonase，aiiA)基因編碼的AiiA蛋白可以破壞植物病原細菌產(chǎn)生的信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones，AHLs)信號分子，干擾該信號分子介導的群體感應，減弱致病菌對植物產(chǎn)生的危害。
　　 構(gòu)建攜帶N-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶基因(aiiA)的重組畢赤酵母表達載體pPIC3.5K-aiiA，采用電轉(zhuǎn)化方法導入畢赤酵母GS115，經(jīng)

2、營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、表型鑒定和高G418濃度篩選獲得高拷貝表達盒的酵母轉(zhuǎn)化子，用0.5[％]甲醇誘導表達，RT-PCR鑒定可檢測到重組酵母中編碼目的基因成熟肽的mRNA，SDS-PAGE和Western Blot檢測結(jié)果表明，aiiA基因在畢赤酵母中成功表達，用指示菌紫色桿菌CV026檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白具有降解N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯的活性。
　　 構(gòu)建了分泌型表達載體pPIC9K-aiiA，SacⅠ酶切后，將其轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115

3、，經(jīng)過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基、表型鑒定和G418篩選含高拷貝表達盒的酵母轉(zhuǎn)化子重組酵母菌GS115(pPIC9K-aiiA)，目的菌株用甲醇誘導后，上清未見有目的蛋白條帶出現(xiàn)，濃縮后的上清也沒有活性，報告菌檢測胞內(nèi)蛋白提取物存在活性。
　　 將aiiA基因克隆到表達載體pET28a構(gòu)建重組表達載體pET28a-aiiA，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，0.8mM IPTG誘導，SDS-PAGE和Western Blot檢測結(jié)果表明