RNAi干涉家蠶細(xì)胞AGO蛋白家族的表達(dá)研究.pdf

1、Argonaute(AGO)蛋白是一類(lèi)高度保守的堿性蛋白家族，主要包括4個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是N端、PAZ、Middle和PIWI。其中PIWI具有RNaseH酶的活性，可以與siRNA(smallinterferingRNA)結(jié)合切割mRNA，PAZ可以非特異性的識(shí)別結(jié)合雙鏈小RNA3’端懸垂的兩個(gè)核苷酸，因此AGO蛋白參與到smallRNA(如miRNA、siRNA)的基因調(diào)控之中，AGO蛋白主要以RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的形式來(lái)

2、發(fā)揮功能。AGO蛋白功能的研究將更加有利用于揭示生物體內(nèi)的基因調(diào)控機(jī)制，從而為人類(lèi)疾病治療和生物遺傳發(fā)育的研究提供更加有利的條件。
　　 家蠶作為人類(lèi)最早馴化的動(dòng)物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)作為鱗翅目的模式生物，在研究昆蟲(chóng)的變態(tài)發(fā)育及農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)防治中也發(fā)揮著重要的作用。目前，在家蠶發(fā)現(xiàn)的AGO蛋白有4種，分別是AGO1、AGO2、AGO3和PIWI，其功能目前研究的還不是很清楚。在本研究中以家蠶細(xì)胞BmN為研究對(duì)象，通過(guò)構(gòu)建

3、RNAi干擾載體，試圖探究蛋白AGO1和AGO2在家蠶細(xì)胞中的功能，為進(jìn)一步研究smallRNA和靶標(biāo)基因之間的作用機(jī)制提供初步基礎(chǔ)。
　　 RNAi載體的構(gòu)建主要是根據(jù)基因沉默的原理，RNAi載體在家蠶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成特定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)hairpinRNA，在Dicer酶的作用下，切割成siRNA，干擾AGO1和AGO2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中用到的載體是pBac[A3-EGFPafm]和輔助質(zhì)粒phsp，輔助質(zhì)粒可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)轉(zhuǎn)座酶，將構(gòu)建

4、成功的RNAi載體和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到家蠶細(xì)胞BmN中，在輔助質(zhì)粒的作用下，可以將干擾片段整合到基因組上，穩(wěn)定表達(dá)。
　　 利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將構(gòu)建好的載體和輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到家蠶細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后開(kāi)始觀察細(xì)胞，直到96h后觀察到綠色熒光，連續(xù)觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)變化，7天后收集細(xì)胞并提取總RNA，利用real-time熒光定量PCR鑒定AGO1和AGO2基因表達(dá)的變化，本研究中以家蠶Actin-3為內(nèi)參，結(jié)果顯示AGO1和AG