家蠶蛻皮激素受體和超氣門蛋白基因的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、昆蟲主要依靠體內(nèi)蛻皮激素滴度的變化，調(diào)節(jié)幼蟲蛻皮、蛹變態(tài)和成蟲分化等胚后發(fā)育。昆蟲蛻皮激素受體(ecdysonereceptor，EcR)和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)是核內(nèi)受體，是蛻皮激素的分子靶標(biāo)。因此研究蛻皮激素與EcR和USP的作用方式和調(diào)控機(jī)理具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 用2×10-3μg/μL蛻皮激素溶液浸泡過(guò)的桑葉飼喂家蠶5齡幼蟲，采用雙跟蹤標(biāo)定定量PCR（dual-spike-inqP

2、CR）方法，檢測(cè)BmEcR-A、BmEcR-B1和超氣門蛋白(ultraspiracle，USP)基因BmUSP在家蠶馬氏管、脂肪體、中腸組織的轉(zhuǎn)錄水平變化，通過(guò)比較組織間的轉(zhuǎn)錄水平，分析EcR和USP基因在蛻皮激素代謝過(guò)程中的作用與表達(dá)調(diào)控特征。
　　 結(jié)果：表明：家蠶EcR的2種同工型基因BmEcR-A和BmEcR-B1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均變化顯著，在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平最高，其它組織相對(duì)較低；BmUSP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣

3、變化顯著，且在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平最高，馬氏管次之，中腸最低。
　　 另檢測(cè)正常狀態(tài)下4齡眠期和5齡末期BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP的mRNA轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)其它時(shí)期較高，且脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平要明顯高于其它組織。BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP均在家蠶幼蟲脂肪體中高量表達(dá)，表明脂肪體是蛻皮激素重要的靶組織。
　　 我們發(fā)現(xiàn)，BmEcR-A在家蠶幼蟲中的表達(dá)水平高于BmEcR-B1，而BmUSP的表達(dá)

4、水平要明顯高于BmEcR-A和BmEcR-B1，BmEcR-A和BmUSP從表達(dá)時(shí)間要早于BmEcR-B1，這說(shuō)明BmEcR-A先于BmEcR-B1發(fā)揮生理功能，同時(shí)本研究結(jié)果表明，在家蠶中EcR-A發(fā)揮著比EcR-B1更為重要的作用。
　　 重組AcNPV作為用于昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞的真核表達(dá)載體，可感染部分家蠶品種，且感染癥狀較BmNPV輕，可以存活較長(zhǎng)時(shí)間，且不會(huì)經(jīng)口傳染，因此將它用作一種瞬時(shí)表達(dá)載體來(lái)研究基因的功能及其表達(dá)調(diào)控具

5、有一定的優(yōu)越性。為了研究蛻皮激素受體(EcR)和超氣門蛋白(USP)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，我們利用rAcMNPV作為基因介導(dǎo)載體的雙熒光定量表達(dá)載體系統(tǒng)對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)域的功能進(jìn)行分析。
　　 首先，構(gòu)建一個(gè)FHNLuc-A3RL雙熒光供體質(zhì)粒，其中螢火蟲熒光素酶(FLuc)基因由EcR和USP基因的啟動(dòng)子帶動(dòng)，另一個(gè)由家蠶A3啟動(dòng)子控制的海腎熒光素酶(RLuc)作內(nèi)參。將BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因啟動(dòng)子進(jìn)行5’

6、端分段順次缺失，將各啟動(dòng)子片段分別裝入雙熒光質(zhì)粒FHNLuc-A3RL中，成功獲得重組的轉(zhuǎn)移載體，通過(guò)Bac-to-Bac系統(tǒng)制備重組桿狀病毒，并制備空白對(duì)照病毒。將這些重組病毒分別注射感染五齡起家蠶，三天后剖取各組織，分別測(cè)定報(bào)告基因FLuc和RLuc的酶活。
　　 結(jié)果：表明，在2×10-3μg/μL蛻皮激素誘導(dǎo)下，家蠶各組織BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因的表達(dá)均比正常組織上調(diào)2-3倍左右；正常狀態(tài)下和外源

7、蛻皮激素誘導(dǎo)下，各基因啟動(dòng)子活性都是在脂肪體中最高，再次表明脂肪體是蛻皮激素重要的靶組織。
　　 BmEcR-A基因啟動(dòng)子-637～-274區(qū)域內(nèi)存在該啟動(dòng)子活性相關(guān)的重要元件，是該基因啟動(dòng)子的主要活性區(qū)域；BmEcR-B1基因啟動(dòng)子的關(guān)鍵區(qū)域位于-435～+1，且-807～-435區(qū)域存在能增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的元件；BmUSP基因啟動(dòng)子-1134～-615和-615～-281區(qū)域內(nèi)存在啟動(dòng)子活性相關(guān)的重要元件，是該基因啟動(dòng)子的主要

8、活性區(qū)域。
　　 在脂肪體中，BmEcR-A基因啟動(dòng)子-637～-274區(qū)域內(nèi)存在與20E誘導(dǎo)相關(guān)的作用元件；BmEcR-B1基因啟動(dòng)子-435～+1區(qū)域內(nèi)存在與20E誘導(dǎo)相關(guān)的作用元件；BmUSP基因啟動(dòng)子-1134～-615和-615～-281區(qū)域內(nèi)存在與20E誘導(dǎo)相關(guān)的作用元件。馬氏管及其它組織BmEcR-A、BmEcR-B1和BmUSP基因啟動(dòng)子的活性與脂肪體中類似。
　　 總之，我們的結(jié)果表明脂肪體是蛻皮激素重