蛻皮激素誘導的絲腺相關基因表達研究.pdf

1、在實時熒光定量PCR中一般采用各種不同的管家基因作為內源參照基因對目的基因進行校正，以消除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質量以及逆轉錄效率上可能存在的差別。理想的內參基因應在各種實驗因素條件下，各種類型的組織或細胞中均恒定表達。然而，大量的研究結果表明，內參基因的表達并不穩(wěn)定，如果沒有合適的標準化處理，盲目地使用某一管家基因作為內參，可能導致錯誤甚至相反的結論。
　　本文按照MIQE規(guī)則檢測了家蠶7種常用內參基因(Actin3、GAPDH

2、、28SrRNA、RPL3、α-Tubulin、UBC和TBP)正常條件下的不同發(fā)育時期及蛻皮激素誘導條件下在不同組織的轉錄表達水平,并利用標準化分析軟件geNorm和NormFinder進行穩(wěn)定性分析，找到了不同實驗條件下在不同組織中相對穩(wěn)定表達的基因。利用篩選出的內參基因檢測了Fib-H，F(xiàn)ib-L，F(xiàn)mbp-1和SGF-1基因在家蠶后部絲腺，P25，Ser-1，SGF-1和Fmbp-1基因在中部絲腺，F(xiàn)ib-H，F(xiàn)ib-L，SGF

3、-1和Fmbp-1基因在脂肪體組織中的轉錄水平變化，通過比較組織間的轉錄水平，分析蠶體組織以及Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1、SGF-1、Fmbp-1基因在蛻皮激素誘導后的表達調控特征。研究結果如下：
　　1.正常條件下內參基因的穩(wěn)定性
　　采用RT-PCR檢測了7種內參基因在家蠶五齡第一天至第七天的表達水平，然后使用內參基因穩(wěn)定性分析軟件geNorm和NormFinder對內參基因的穩(wěn)定性進行評估。軟件分析結果

4、顯示在不同組織中相對穩(wěn)定的基因是不同的，其中α-Tubulin、GAPDH在中部絲腺，GAPDH、UBC在后部絲腺，α-Tubulin、UBC在脂肪體組織中表達相對較為穩(wěn)定。
　　2.蛻皮激素誘導刺激條件下內參基因的穩(wěn)定性
　　使用geNorm和NormFinder軟件分別對候選的7種內參基因在20E誘導條件下五齡第2天0至72 h的表達水平進行評估。其中內參基因α-Tubulin、28SrRNA在中部絲腺，GAPDH和28

5、SrRNA在后部絲腺，α-Tubulin和UBC在脂肪體中的表達相對穩(wěn)定。
　　3.蛻皮激素誘導后Fib-H、Fib-L、P25、Ser-1、SGF-1和Fmbp-1基因的組織轉錄水平分析
　　蛻皮激素誘導后Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25，Ser-1基因在后部絲腺、中部絲腺中的表達量都有不同程度的降低，表明家蠶五齡幼蟲早期階段外源添食蛻皮激素對于Fib-H，F(xiàn)ib-L，P25和Ser-1基因表達有一定抑制作用。SGF-1和F

6、mbp-1基因在蛻皮激素誘導后在后部絲腺、中部絲腺中的表達量分別在不同的時間點出現(xiàn)了升高，表明蛻皮激素可以促進SGF-1和Fmbp-1基因的表達。絲蛋白基因的表達有眾多的調控因子，關于表達調控的復雜網(wǎng)絡還有待于進一步研究。
　　本研究按照MIQE規(guī)則對家蠶常用的七種內參基因在正常條件下的不同發(fā)育時期及蛻皮激素誘導條件下在不同組織中的穩(wěn)定性進行分析，研究發(fā)現(xiàn)，在不同實驗條件下，不同組織中最穩(wěn)定的內參基因是不同的。在實時熒光定量PCR