蛻皮激素誘導(dǎo)人IGF-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立.pdf

1、為了能夠方便、準(zhǔn)確而且真實(shí)地研究IGF-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育過程中以及在各種應(yīng)激、脅迫或疾病條件下所發(fā)揮的神經(jīng)生物學(xué)作用及其作用機(jī)制,特別需要建立一個(gè)能夠在不同的時(shí)相下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性即時(shí)性表達(dá)人IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)基因小鼠模型,為此開展了下面的研究.首先,需要得到一個(gè)能夠指導(dǎo)外源蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子.神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)

2、胞的主要骨架蛋白,該蛋白的表達(dá)主要局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,傳統(tǒng)上被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物.由于當(dāng)時(shí)GFAP基因的調(diào)控序列尚屬未知,因此需要克隆小鼠GFAP基因的5'端調(diào)控區(qū).該研究采用PCR方法篩選129sv小鼠的基因組文庫(kù),經(jīng)過兩輪的PCR篩選和一次噬菌斑原位雜交,成功地從文庫(kù)中分離到載有GFAP基因的陽(yáng)性噬菌體,最終獲得了包括GFAP基因1.8Kb的5'端調(diào)控區(qū)和部分編碼區(qū)在內(nèi)2353bp的核苷酸序列,該段序列

3、已經(jīng)被GeneBank收錄(收錄號(hào):AY279974).經(jīng)與GeneBank中已有的GFAP基因序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)不同種屬小鼠的GFAP基因存在不同的翻譯起始位點(diǎn)和N端氨基酸序列.我們利用得到的GFAP基因1.8Kb的5'端調(diào)控區(qū)構(gòu)建了中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因載體pGFAP-Cre-hGH.通過顯微注射的方法獲得了7只基因組中整合有pGFAP-Cre-hGH的轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為:GFAP-Cre).PCR和Southe

4、rn檢測(cè)都證實(shí)7只GFAP-Cre鼠的基因組中的確整合有轉(zhuǎn)入基因.將GFAP-Cre鼠與ROSA26小鼠進(jìn)行交配,檢測(cè)GFAP-Cre鼠中Cre重組酶的表達(dá)情況.分別選取同時(shí)攜帶有兩種基因發(fā)育至13d的小鼠胚胎和兩周齡小鼠的各種組織制作切片進(jìn)行LacZ染色.結(jié)果證明只有GFAP-Cre鼠的腦部廣泛表達(dá)有活性的Cre重組酶,在間腦的脈絡(luò)叢區(qū)表達(dá)尤為集中,具有理想的組織特異性.我們還構(gòu)建了包含由LoxP序列錨定的neomycin基因組成的阻

5、斷序列、蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和截短型人IGF-Ⅰ的表達(dá)框在內(nèi)的受控型蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)人IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)基因載體pCE-IGF-Ⅰ.將pCE-IGF-Ⅰ轉(zhuǎn)染AM1菌感受態(tài),利用其中表達(dá)的Cre重組酶將LoxP序列錨定的neomycin基因刪除,解除對(duì)前面啟動(dòng)子的阻斷作用.將GFAP-Cre鼠與CE-IGF-Ⅰ鼠進(jìn)行交配,選取攜帶有兩種基因的子代鼠,此類鼠即為我們最后的目的鼠—蛻皮激素誘導(dǎo)截短型人IGF-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠

6、模型.利用PCR方法檢測(cè)證實(shí)腦部特異性表達(dá)的Cre重組酶介導(dǎo)了其間LoxP位點(diǎn)間neomycin的刪除.利用RT-PCR方法檢測(cè)證實(shí)刪除阻斷序列后蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子VgEcR和RXR進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄,并且在Muristerone A誘導(dǎo)后成功地激活了后面表達(dá)框內(nèi)人IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)錄.選取經(jīng)Muristerone A誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)基因鼠腦組織制做切片進(jìn)行免疫組化染色.染色結(jié)果證明:經(jīng)Muristerone A誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)基因鼠的腦部