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文檔簡介
1、研究背景:昆蟲的生長發(fā)育是通過定期的蛻皮實現(xiàn)的,蛻皮過程是在甾醇、保幼激素、20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)等幾種昆蟲激素的調節(jié)下完成的。20E的受體是種核受體,由蛻皮激素受體(ecdysone receptor,EcR)及超螺旋蛋白(ultraspiracle protein,USP)組成,在20E的誘導下EcR與USP結合形成二聚體時,只有EcR/USP二聚體才能與位于蛻皮激素可誘導基因啟動子區(qū)的蛻
2、皮激素響應元件(ecdysone response element,EcRE)相結合而啟動早期基因的轉錄。如果這種激素依賴性的生化代謝的任何步驟受到干擾,都可能導致靶昆蟲的死亡或生長發(fā)育異常。目前,已有20多種昆蟲的EcR和(或)USP被克隆,其中EcR具有種類和種群的特異性,而EcRE的結構則以黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的小分子熱休克蛋白基因啟動子(Hsp27-promoter)最為典型。目前第一、二代
3、殺蟲劑環(huán)境危害性弊端突顯,而昆蟲抗藥性則是第三代殺蟲劑面臨的主要問題,開發(fā)多種殺蟲劑循環(huán),聯(lián)合使用則是減少害蟲抗藥性產(chǎn)生的首要途徑,所以建立能夠高效篩選新型殺蟲劑的高通量篩選模型迫在眉睫,Hien TT等<'[7]>在酵母中建立了一個針對云杉色卷蛾(Chortoneura fumiferana,Cf)EcR的配體調節(jié)轉錄激活(transactivation)系統(tǒng),應用果蠅Hsp27啟動子序列上的響應元件EcRE(23bp),連接上CYC
4、l(iso-1-cytochrome C)啟動子,在CfEcR及CfUSP同時存在時,在沒有配體存在的情況下,EcR與USP也可自發(fā)形成二聚體使報告基因強烈表達。因而我們可以在酵母體內(nèi)組成型表達衛(wèi)生害蟲的EcR及USP,用EcR/USP二聚體啟動果蠅EcRE-Hsp27啟動子,使得昆蟲蛻皮調節(jié)通路關鍵調節(jié)階段在酵母中重現(xiàn),并且在啟動子后連接綠色熒光蛋GFP報告基因,利用這個模型來篩選作用于調節(jié)通路的藥物,進而開發(fā)出活性高、專一性強、對人
5、畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。目的:建立衛(wèi)生害蟲蛻皮激素類似物殺蟲劑篩選模型,通過此構建的酵母模型篩選昆蟲蛻皮激素受體結合調節(jié)劑,然后利用篩出的藥物作用于衛(wèi)生害蟲,進而開發(fā)出活性高、專一性強、對人畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。 方法:人工合成白紋伊蚊(Aedes albopictus)EcR和USP的編碼序列,兩個基因以雙表達盒形式亞克隆入表達質粒pGAP-Z,并整合到畢赤酵母(Pichiapastori
6、s)的染色體上使 EcR與USP在酵母中組成型表達,構建成酵母A。人工合成果蠅EcRE,從果蠅基因組DNA中擴出Hsp27-promoter序列,再接上綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein,GFP)報告基因,將:EcRE-Hsp27promoter-GFP片段亞克隆入pPIC3.5k,并整合到畢赤酵母A染色體的另一位點上(pGAP-Z與pPIC3.5k與畢赤酵母染色體的整合位點不同),從而構建成酵母模型(酵
7、母B),通過施加蛻皮激素類似物二芳酰肼類農(nóng)藥蟲酰肼驗證酵母模型的敏感性,并初步使用酵母模型篩選一部分放線菌分泌物。 結果:成功的構建了酵母表達質粒pGAP-Z-TEF-USP-CYC-EcR、pPIC3.5K-ECRE-Hsp-GFP,轉化后的酵母模型在熒光顯微鏡下可見綠色熒光,證明EcR、USP在酵母中成功表達,兩者結合形成的 EcR/USP二聚體作用于EcRE啟動報告基因表達熒光蛋白。施加藥物蟲酰肼后模型酵母熒光強亮度遠低于
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