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文檔簡介
1、目的:傳統(tǒng)前列腺癌治療手段效果不佳,基因治療有望成為新型高效治療手段。前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)針對survivin基因進(jìn)行RNA干涉能有效促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡,但survivin-siRNA體內(nèi)遞送效率低下和靶向性差的問題依然沒能解決,故本課題旨在構(gòu)建一種高效靶向survivin-siRNA遞送系統(tǒng),用抗PMSA適配子介導(dǎo)靶向,穿膜肽TAT提高遞送效率,提高survivin-siRNA在前列腺癌治療中的特異殺傷效率。
方法:構(gòu)建pET-
2、44b-3TAT-DRBD表達(dá)載體,用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白3TAT-DRBD表達(dá),鎳親和凝膠層析柱純化融合蛋白,凝血酶切除標(biāo)簽,Western blotting鑒定。凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DRBD的siRNA結(jié)合能力,激光共聚焦顯微鏡觀察TAT的穿膜能力。
結(jié)果:雙酶切和DNA序列測定表明所構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-44b-3TAT-DRBD與設(shè)計一致;IPTG誘導(dǎo)后3TAT-DRBD融合蛋白(含Nus標(biāo)簽和S標(biāo)簽)在大腸桿菌中高效表
3、達(dá),可溶性蛋白占菌體總蛋白的80%;用凝血酶成功切除融合標(biāo)簽并純化了無標(biāo)簽的融合蛋白,經(jīng)Western blotting鑒定其相對分子量約為17000Da;電泳遷移阻滯實(shí)驗(yàn)證明融合蛋白3TAT-DRBD能有效結(jié)合靶向survivin基因的siRNA(survivin-siRNA),經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察在TAT的介導(dǎo)下survivin-siRNA穿透胞膜進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞的效率明顯增高。
結(jié)論:成功表達(dá)并純化了具有siRNA結(jié)合
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