BAFF及其受體融合蛋白的構(gòu)建表達(dá)純化與功能鑒定.pdf

1、B細(xì)胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)，又稱為B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)是TNF家族成員之一。它可特異性的刺激B淋巴細(xì)胞增殖、分化和分泌抗體，對(duì)B細(xì)胞的存活、發(fā)育、分化起到重要的調(diào)控作用。BAFF可與三種受體：BCMA、TACI和BAFF-R結(jié)合，通過激活NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)B細(xì)胞的抗凋

2、亡能力。BAFF的過表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)及干燥綜合征(SS)等許多自身免疫性疾病及B細(xì)胞腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。
　　 由于受體與BAFF具有高親和力，可特異性識(shí)別BAFF并與之結(jié)合，因此體外構(gòu)建表達(dá)的BAFF受體胞外段融合蛋白可中和體內(nèi)過表達(dá)的BAFF，控制B細(xì)胞的增殖和活化，緩解和治療與BAFF相關(guān)的自身免疫病和B細(xì)胞腫瘤。本課題的研究為開發(fā)BAFF拮抗劑治療BAFF相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)

3、基礎(chǔ)。
　　 本課題研究方法：對(duì)BAFF及其受體融合蛋白原核重組表達(dá)載體進(jìn)行鑒定，表達(dá)受體和配體蛋白并對(duì)其進(jìn)行純化，在體外研究受體與配體相互作用，并在細(xì)胞水平鑒定受體中和配體功能的活性。
　　 主要研究結(jié)果：
　　 (一)BAFF及其受體融合蛋白原核重組表達(dá)載體的鑒定：本實(shí)驗(yàn)室已將釣取的BAFF及其受體基因片段連接到原核表達(dá)載體pET-32a或pGEX6p-1上，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定

4、，證明表達(dá)載體構(gòu)建正確。
　　 (二)BAFF及其受體融合蛋白的表達(dá)與純化：重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Posetta(DE3)、JM109等。在IPTG誘導(dǎo)下，使基因在工程菌中表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE鑒定。融合蛋白分別利用鎳金屬螯合瓊脂糖凝膠親和層析柱和谷胱甘肽-瓊脂糖珠混懸液純化，經(jīng)濃縮和濃度測(cè)定后分裝凍干保存。
　　 (三)BAFF受體融合蛋白的活性鑒定：首先通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了BAFF與受體融合蛋白在體外結(jié)合情況。然