TAT-Ngb融合蛋白的原核表達及其對小鼠腦缺血影響的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 腦血管病是危害極大的常見病、多發(fā)病，目前缺乏切實有效的腦保護劑。腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是本世紀新發(fā)現(xiàn)的第三種攜氧球蛋白，能與氧可逆性結(jié)合，主要存在于腦內(nèi)。已有研究表明Ngb可減輕神經(jīng)元及腦組織的缺血缺氧性損傷，因此有望成為新型腦保護劑。然而，Ngb是一個大分子蛋白，無法透過細胞膜，更無法透過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)到達腦內(nèi)，限制了它在臨床的直接應(yīng)用。TAT

2、蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain，PTD)能攜帶大分子蛋白從血液中迅速透過BBB進入腦內(nèi)。利用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將可能解決Ngb自身無法透過BBB進入腦內(nèi)細胞發(fā)揮腦保護作用的瓶頸問題。目前，已有離體研究表明原核表達的TAT-Ngb融合蛋白(簡稱TAT-Ngb)能轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元和人的胰島細胞并發(fā)揮抗缺氧損傷作用。但迄今為止，國內(nèi)外尚未見有動物在體驗證TAT-Ngb透過BBB功能進入腦內(nèi)

3、并發(fā)揮腦保護作用的研究報道。
　　 本研究擬通過原核表達方法制備融合蛋白TAT-Ngb，聯(lián)合Western Blot及免疫熒光染色驗證TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能，并用TAT-Ngb治療小鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，觀察TAT-Ngb在局灶性腦缺血中的腦保護作用，探討其可能的保護機制，為腦血管病的神經(jīng)保護治療提供新的方向和思路。
　　 方法:<

4、br>　　 1.構(gòu)建pET28b-TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達TAT-Ngb及Ngb融合蛋白，表達產(chǎn)物通過SDS-PAGE進行蛋白表達高峰及可溶性分析，并行Western Blot鑒定，Ni-NTA Resin親和層析柱純化蛋白，PD-10脫鹽柱進行蛋白脫鹽。
　　 2.將TAT-Ngb或Ngb尾靜脈注射近交系C57BL/6J小鼠，1或4h后處死小鼠取腦，以Ngb

5、單克隆抗體為一抗， Western Blot、免疫熒光染色對注射TAT-Ngb后的小鼠腦組織分別進行Ngb蛋白定量、定位檢測，驗證TAT-Ngb穿透小鼠BBB的功能。
　　 3.采用線栓法制備小鼠的MCAO局灶性腦缺血-再灌注模型，缺血時間為30min或2h。模型制備中采用以下措施以使模型穩(wěn)定：面罩吸入異氟烷麻醉；監(jiān)測并維持平均動脈血壓、血氣指標、體溫在正常范圍；術(shù)中還通過腦血流儀監(jiān)測來判斷血流下降程度，使腦缺血程度基本一致。再

6、灌注24h或72h后進行神經(jīng)功能缺損評分，處死動物并制備腦組織石蠟切片，分別行HE染色、尼氏染色和TUNEL染色。
　　 4.MCAO缺血2h再灌注24h組分四個亞組，分別于MCAO前2h靜脈注射生理鹽水、Ngb或TAT-Ngb進行預(yù)先干預(yù)，或缺血2h時(再灌注即刻)靜脈注射TAT-Ngb治療。再灌注24h后進行神經(jīng)功能缺損評分，處死動物并取腦進行TTC染色，測量并計算出腦梗死體積。
　　 5.MCAO缺血30min再灌

7、注72h組分三個亞組，于MCAO缺血30min時(再灌注即刻)分別靜脈注射生理鹽水、Ngb或TAT-Ngb治療。再灌注72h后進行神經(jīng)功能缺損評分，處死動物并制備腦組織石蠟切片，使用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP nick end-labeling，TUNEL)染色檢測細胞凋亡，使用焦油紫進行尼氏染色，在每張腦組織切片的紋狀體區(qū)觀察6個高

8、倍視野并計數(shù)，計數(shù)每高倍視野的TUNEL陽性細胞，同樣方法在尼氏染色切片中計數(shù)存活神經(jīng)元和壞死神經(jīng)元，神經(jīng)元存活率=存活神經(jīng)元/(存活神經(jīng)元+壞死神經(jīng)元)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建pET28b-TAT-Ngb及pET28b-Ngb原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)蛋白表達，經(jīng)純化、脫鹽后獲得高產(chǎn)量的TAT-Ngb及Ngb融合蛋白。
　　 2.Western Blot檢測表明TAT-Ngb注射4h后進入了腦內(nèi);而Ngb注

9、射4h后未能進入腦內(nèi)。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)TAT-Ngb注射1h后進入了腦內(nèi)毛細血管壁，4h后進入了腦組織神經(jīng)元，在細胞漿彌散表達；而Ngb注射4h后未能進入了腦組織。
　　 3.采用線栓法成功建立了穩(wěn)定的小鼠MCAO再灌注模型。缺血2h組和30min組小鼠神經(jīng)功能缺損評分分別為2.67±0.82和0分；2h MCAO腦缺血導(dǎo)致皮質(zhì)紋狀體梗死，而30min MCAO腦缺血導(dǎo)致局限于紋狀體的選擇性神經(jīng)元損傷。
　　 4.在MC

10、AO缺血2h再灌注24h組，與生理鹽水組相比，缺血前應(yīng)用TAT-Ngb能明顯減少梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分(p＜0.01)；而且在缺血2h后(再灌注即刻)應(yīng)用TAT-Ngb治療組中，梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分也有下降趨勢，但未能達到統(tǒng)計學(xué)的顯著差異(p＞0.05)。可是，與生理鹽水組相比，Ngb治療組的腦梗死體積及神經(jīng)功能缺損評分無明顯下降。
　　 5.在MCAO缺血30min再灌注72h組，與生理鹽水組相比，TAT-Ngb組紋

11、狀體的神經(jīng)元存活率明顯增加(p＜0.01)，凋亡細胞數(shù)顯著減少(p＜0.01)；而Ngb組中神經(jīng)元存活率和凋亡細胞的數(shù)目無明顯變化。
　　 結(jié)論:
　　 1.通過原核表達方法成功表達獲得高產(chǎn)量的TAT-Ngb及Ngb融合蛋白。
　　 2.TAT能介導(dǎo)Ngb透過BBB進入小鼠腦組織細胞。
　　 3.按照國際標準，采用線栓法成功建立了小鼠腦缺血時間為2h或30min的MCAO再灌注模型，模型成功率高，可重復(fù)性