細(xì)胞穿膜肽TaT-Hsp70融合蛋白對(duì)小鼠早期體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、細(xì)胞穿膜肽Tat是一種能攜帶生物大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的一段氨基酸序列，通過(guò)這種方式進(jìn)入細(xì)胞的大分子物質(zhì)會(huì)保持其原有生物學(xué)活性，這種特性為將目的蛋白轉(zhuǎn)入細(xì)胞提供了新的途徑。本試驗(yàn)在表達(dá)得到具有穿膜功能的Hsp70-Tat-Hsp70的基礎(chǔ)上，通過(guò)將其加入胚胎培養(yǎng)液中，統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率和孵出率的方法，研究在培養(yǎng)液中添加Tat-Hsp70融合蛋白對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育影響。試驗(yàn)方法及結(jié)果如下:
　　 1.小鼠Tat-Hsp70原核表達(dá)載體的構(gòu)

2、建及表達(dá)
　　 TRIzol法提取小鼠肝臟總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，陽(yáng)性菌落經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序。以pMD-18T/Hsp70質(zhì)粒為模板，利用PCR的方法成功將Tat基因連入，并構(gòu)建成pEASY-E1/Tat-Hsp70表達(dá)載體，測(cè)序鑒定后進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示該蛋白以可溶性蛋白形式存在，最佳表達(dá)條件為:溫度30℃，IPTG濃度0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)

3、間3h，western blot檢測(cè)說(shuō)明其具有生物學(xué)活性。
　　 2.含有Tat-Hsp70融合蛋白的CZB培養(yǎng)對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育的影響
　　 分別配制CZB及TCZB（含有Tat-Hsp70融合蛋白的CZB培養(yǎng)液），當(dāng)胚胎發(fā)育到4細(xì)胞后，將胚胎隨機(jī)分組,分別換用CZB和TCZB進(jìn)行培養(yǎng)，換液2h后分別進(jìn)行39℃和41℃的熱應(yīng)激處理2h，處理完畢恢復(fù)37℃正常溫度進(jìn)行培養(yǎng)，分別統(tǒng)計(jì)囊胚發(fā)育率和孵出率，以37℃正常培養(yǎng)的胚

4、胎為對(duì)照。結(jié)果顯示39℃熱應(yīng)激后，囊胚發(fā)育率和孵出率在CZB組（80.2±5.4和73.4±6.2）與TCZB組（81.3±4.5和76.5±7.6）間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，與對(duì)照組(83.7±6.1和75.6±4.5)比亦無(wú)顯著差異(P＞0.05);而41℃熱應(yīng)激后，囊胚發(fā)育率和孵出率在CZB組（80.2±5.4和73.4±6.2）、TCZB組(81.3±4.5和76.5±7.6)與對(duì)照組三組之間存在顯著差異(P＜0.05)，對(duì)