TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、中風是世界第二位、我國第一位的致死性疾病,更是成年人致殘的首要病因。而中風后神經元壞死和凋亡導致的神經元缺失(loss of neuron)以及突觸功能異常則為中風后神經功能障礙的最根本原因。目前除了再灌注治療(t-PA,血管再通術)可臨床應用、造?；颊?抗興奮性毒性、抗氧化、抗凋亡、抗炎等新治療措施均在臨床實驗中因為效果不佳或毒副作用而失敗。因此,尋找能夠有效減輕腦缺血后神經元損傷、抑制神經元凋亡,促進神經發(fā)生并重建神經環(huán)路的新治療靶

2、點或藥物,成為了中風治療的重點和難點。
　　成年哺乳動物神經發(fā)生(neurogenesis)的發(fā)現,為中風后神經功能康復帶來了曙光。而神經源素2(Ngn2)作為 bHLH轉錄因子家族的成員,在成年哺乳動物神經發(fā)生的調節(jié)中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現,Ngn2不僅是啟動神經發(fā)生的重要因子,還參與調節(jié)神經元的終末分化,調控神經前體細胞的遷移與成熟,影響軸突投射和樹突形成。不僅如此,單純應用Ngn2就可誘導胚胎干細胞、星形膠
　

3、　質細胞和少突膠質細胞前體細胞分化為具有相應結構和功能的成熟谷氨酸能神經元;而轉染Ngn2還可促進移植后神經前體細胞的存活、分化、遷移與成熟,參與損傷神經環(huán)路和網絡的修復與重建,提示Ngn2可能成為中風治療尤其是康復治療的重要作用靶點。然而,Ngn2因分子量過大,難以通過血腦屏障,限制了其在中樞神經系統(tǒng)疾病中的應用。而我們前期合成的具有血腦屏障通透性和損傷區(qū)域靶向性的TAT-LBD-Ngn2融合蛋白,為進一步明確Ngn2對缺血性腦中風的

4、治療作用及其機制提供了研究基礎。
　　因此,本課題以原代培養(yǎng)的海馬神經元氧糖剝奪(OGD)模型和小鼠全腦缺血(GCI)模型為對象,應用神經行為學、免疫組織化學和western blot等技術,觀察 TAT-LBD-Ngn2對缺血性腦損傷的短期和長期神經保護作用,明確其對神經發(fā)生的促進作用,并初步闡明 TAT-LBD-Ngn2神經保護作用的機制,旨在為缺血性腦中風治療提供新的干預靶點和治療藥物,并為Ngn2神經保護作用的機制研究提供

5、新的思路。
　　實驗一 TAT-LBD-Ngn2對氧糖剝奪原代神經元的保護作用及其機制研究
　　目的:通過離體研究,明確TAT-LBD-Ngn2對氧糖剝奪的原代培養(yǎng)神經元是否具有保護作用,并初步探討其機制。
　　方法:采用原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經元,以125μg/L濃度的Ngn2、TAT-LBD、TAT-LBD-Ngn2分別孵育神經元6h,通過免疫細胞化學觀察各藥物對細胞膜的通透性,并進一步明確各藥物對原代培養(yǎng)海馬神經元

6、神經突生長的影響。再分為5組:Control組、OGD組、OGD+TAT-LBD-Ngn2(62.5μg/L)組、OGD+TAT-LBD-Ngn2(125μg/L)組和OGD+TAT-LBD-Ngn2(250μg/L)組。OGD復氧后24h后,應用MTT比色法檢測神經元細胞活力,應用LDH釋放試驗檢測神經元損傷程度,應用TUNEL染色觀察神經元的凋亡情況,并進一步應用Elisa和Western Blot檢測凋亡相關蛋白Caspase-3

7、、Bcl-2和Bax的表達水平。
　　結果:125μg/L的TAT-Ngn2和TAT-LBD-Ngn2均可通過細胞膜,并促進原代培養(yǎng)海馬神經元的神經突生長(P<0.05)。OGD模型24h后,TAT-LBD-Ngn2組的細胞活力顯著提高(P<0.01),LDH釋放減少(P<0.01),并且細胞活力的改善與TAT-LBD-Ngn2的藥物濃度呈劑量依賴關系,250μg/L的TAT-LBD-Ngn2具有最大的神經保護作用。同時,TAT-

8、LBD-Ngn2組TUNEL陽性神經元的數量明顯減少(P<0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達明顯受到抑制(P<0.01),而抗凋亡蛋白Bcl-2水平顯著增高(P<0.01),TAT-LBD-Ngn2的抗凋亡作用同樣具有劑量依賴性,于250μg/L時達到最大保護效果。
　　結論:TAT-LBD-Ngn2可透過神經元細胞膜,促進神經突生長;還可通過抑制內源性和外源性的凋亡通路,減少神經元凋亡,減輕缺血再灌注損傷。<

9、br>　　實驗二TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷短期保護作用及其機制的研究
　　目的:通過在體研究,明確TAT-LBD-Ngn2對小鼠全腦缺血損傷是否具有保護作用,并初步探討其神經保護作用的機制。
　　方法:采用C57BL/6小鼠,行雙側頸總動脈結扎(BCCAO)術建立GCI模型,隨機分為Control組(PBS200μL, qd ip, n=30)和TAT-LBD-Ngn2組(TAT-LBD-Ngn2250μg/kg,

10、 qd ip, n=30),再灌注即刻首次給藥,此后每天進行藥物腹腔注射。首次藥物注射24h后通過免疫組織化學和Western Blot觀察藥物通過血腦屏障和細胞膜的情況。通過1d、2d和3d的總體運動評分(TMS)觀察BCCAO小鼠術后的神經行為能力。應用TUNEL染色觀察并計數BCCAO后3d神經元的凋亡情況;并應用免疫組織化學觀察神經營養(yǎng)因子(BDNF,NGF)在海馬和皮層的表達情況。
　　結果:在成功建立的全腦缺血模型小鼠

11、中,TAT-LBD-Ngn2可通過血腦屏障進入腦組織,并表達于海馬和皮層的神經元和其他神經細胞。同時,TAT-LBD-Ngn2因對層粘連蛋白的親和力和靶向性,在腦內尤其是海馬區(qū)域的表達顯著高于TAT-Ngn2(P<0.01);TAT-LBD-Ngn2治療可改善BCCAO術后1d、2d和3d小鼠的TMS評分(P<0.05)。TAT-LBD-Ngn2治療還可顯著減少BCCAO術后3d海馬CA1區(qū)TUNEL陽性神經元數目(P<0.05);誘導

12、皮層神經元BDNF的表達,但對NGF的表達則無明顯影響。
　　結論:TAT-LBD-Ngn2可透過血腦屏障,聚集于損傷區(qū)域;還可通過促進BDNF表達,抑制神經元凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷,改善運動功能。
　　實驗三 TAT-LBD-Ngn2對腦缺血損傷長期保護作用及其機制研究
　　目的:觀察TAT-LBD-Ngn2對小鼠全腦缺血損傷后神經功能恢復的影響,并初步探討神經發(fā)生在其中發(fā)揮的作用。
　　方法:采用 C57

13、BL/6小鼠,行 BCCAO術建立 GCI模型,隨機分為 Control組(PBS200μL, qd ip, n=30)和TAT-LBD-Ngn2組(TAT-LBD-Ngn2250μg/kg, qd ip, n=30),于再灌注時開始給藥,持續(xù)14或28d。于BCCAO后14、28d通過曠場試驗觀察小鼠的運動功能,通過Morris水迷宮檢測TAT-LBD-Ngn2對小鼠空間學習和記憶功能的影響。通過免疫組織化學,觀察并計數BCCAO后1

14、4、28d海馬CA1區(qū)神經元數量;觀察海馬齒狀回雙皮質素(DCX)和溴脫氧尿苷(BrdU)陽性的新生神經元數目;檢測突觸素(SYN)在腦內的表達情況以明確新生神經元是否建立了功能性突觸。
　　結果:兩組間小鼠的運動功能無統(tǒng)計學差異。但 Morris水迷宮結果顯示, TAT-LBD-Ngn2組小鼠在14d和28d的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),空間探索試驗中的穿臺次數和目標象限停留時間也明顯優(yōu)于 Control組(P<0.05

15、),具有較好的空間學習和記憶功能。免疫組織化學結果顯示250μg/kg TAT-LBD-Ngn2可顯著提高海馬CA1區(qū)神經元的數量(P<0.05);并增加海馬齒狀回BrdU和DCX陽性神經元的數目(P<0.05),這些新生神經元主要位于海馬齒狀回的顆粒下層;此外,TAT-LBD-Ngn2還增加了皮層和海馬SYN的表達。
　　結論:TAT-LBD-Ngn2治療可促進缺血易損區(qū)海馬CA1區(qū)神經元的存活,顯著改善 BCCAO小鼠的空間學

16、習和記憶功能,其作用可能是通過促進神經發(fā)生,促進突觸結構和功能的重建實現的。
　　小結:通過上述研究證實,TAT-LBD-Ngn2可透過血腦屏障和細胞膜,富集于損傷區(qū)神經元內;TAT-LBD-Ngn2可通過誘導 BDNF的表達,抑制神經元凋亡,減輕腦缺血早期損傷;TAT-LBD-Ngn2還可通過促進神經發(fā)生、重建突觸結構和功能,促進腦缺血性損傷后神經功能的恢復,提示 TAT-LBD-Ngn2可能開發(fā)為臨床治療腦中風的候選藥物。本研