抗菌肽Thanatin與Polh的原核融合表達及其真核表達研究.pdf

1、抗菌肽Thanatin是一個含有21個氨基酸殘基的線性多肽，首次被發(fā)現(xiàn)存在于昆蟲椿(Podisusmaculiventris)中，與蛙(frog)皮膚抗菌肽brevinin家族有很高的序列同源性。其有一個位于C末端的二硫鍵橋環(huán)，屬于陽離子抗菌肽，既抗真菌，又抗細菌，表現(xiàn)出極廣的抗菌譜，具有廣闊的應(yīng)用價值。由于在組織內(nèi)含量微少，所以很難從組織中獲得大量的抗菌肽。通過化學合成的方法獲得抗菌肽成本高，因此利用基因工程的方法生產(chǎn)抗菌肽成為近年來

2、研究的熱點。
　　 本研究首次構(gòu)建了含家蠶核型多角體蛋白Polh與Thanatin融合基因的原核表達載體，進行原核表達，純化后用鹽酸羥胺切割后初步純化獲得具有抗菌活性的Thanatin蛋白；研究首次以昆蟲桿狀病毒體系中表達了椿(Podisusmaculiventris)抗菌肽Thanatin。獲得以下主要結(jié)果：
　　 1.根據(jù)大腸桿菌基因密碼子偏愛性，對Thanatin進行基因優(yōu)化，并用overlapextensionP

3、CR的方法擴增，得到Thanacin基因與家蠶核型多角體病毒多角體蛋白Polyhedrin基因融合基因，將融合基因克隆到表達載體pET28a(+)中，構(gòu)建了表達載體pET-28a-Polyhedrin-Thanatin，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，IPTG誘導表達。大腸桿菌表達產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測，誘導表達的菌體中有與融合蛋白理論值(35kD)相符的目的條帶，凝膠掃描分析目的融合蛋白以包涵體的

4、形式表達，且誘導后6h融合蛋白的表達量最大，約占菌體總蛋白量的30％，表明Polyhedrin-Thanatin融合基因在E.coliBL21(DE3)宿主菌中獲得成功表達。融合蛋白純化后用鹽酸羥胺切割后初步純化，經(jīng)過抑菌試驗結(jié)果表明，表達的Thanatin蛋白具有一定的抑細菌活性。
　　 2.采取Bac-to-Bac表達系統(tǒng)將抗菌肽THanatin基因在昆蟲細胞中表達，將抗菌肽Thanatin基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFas

5、tBacI，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pFastBacI-Thanatin轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，發(fā)生體內(nèi)重組，獲得桿粒Bacmid-Thanatin。桿粒DNA在脂質(zhì)體Lipofectin介導下侵染家蠶細胞(BmN)，獲得含Thanatin基因的重組桿狀病毒，重組病毒感染Bm細胞后，表達目的蛋白。超聲裂解細胞，抑菌試驗結(jié)果顯示，表達的Thanatin蛋白具有抑制大腸桿菌菌活性。為今后進一步的分離純化Thanatin等實驗研究提供依據(jù)