生物科學(xué)畢業(yè)論文三疣梭子蟹crustin抗菌肽原核表達(dá)載體構(gòu)建

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　（20 屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹Crustin抗菌肽原核表達(dá)載體構(gòu)建</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 生物科學(xué) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</

3、b></p><p><b>　　摘要I</b></p><p>　　AbstractII</p><p><b>　　引言1</b></p><p><b>　　1材料與方法3</b></p><p>　　1.1試劑與方法3<

4、/p><p>　　1.1.1材料3</p><p>　　1.1.2培養(yǎng)基及試劑3</p><p>　　1.1.3儀器3</p><p>　　1.1.4實驗所用引物序列3</p><p><b>　　1.2方法4</b></p><p>　　1.2.1三疣梭

5、子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA的提取4</p><p>　　1.2.2目的基因的RT-PCR擴增4</p><p>　　1.2.3添加接頭5</p><p>　　1.2.4擴增產(chǎn)物純化6</p><p>　　1.2.5目的基因片段克隆載體的構(gòu)建6</p><p>　　1.2.6pET-28a原核表達(dá)載體的構(gòu)

6、建7</p><p>　　2結(jié)果與分析11</p><p>　　2.1三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA的提取11</p><p>　　2.2RT-PCR與接頭連接11</p><p>　　2.3克隆載體的構(gòu)建12</p><p>　　2.4表達(dá)載體的構(gòu)建13</p><p>　

7、　2.5本章小結(jié)14</p><p><b>　　3討論15</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　摘要</b></p><p>　　[摘要] Cr

8、ustin最早由Relf等在青蟹Carcinus maenas中分離鑒定，后續(xù)研究表明Crustin普遍存在于甲殼類中，甲殼類crustin以其C末端的WAP結(jié)構(gòu)域為標(biāo)志，也有8個保守的Cys殘基，形成4對分子內(nèi)二硫鍵。實驗室已從三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中克隆出兩個crustin的異構(gòu)體，通過原核表達(dá)載體構(gòu)建研究crustin這兩個異構(gòu)體之間的活性和活性差異。本實驗以三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，EcruS1和EcruR1

9、，Ecr3S1和Ecru3R1分別為I型Crustin和III型Crustin的上下引物，進行RT-PCR,再在上述引物中添加接頭EcruS2和EcruR1，Ecru3S2和Ecru3R1進行PCR，成功擴增到預(yù)期長度一致的單一擴增帶、以pEASY-Blunt simple vector為克隆載體，成功構(gòu)建目的基因片段克隆載體，目的基因克隆載體質(zhì)粒與空白表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a分別雙酶切、割膠回收后，用T4 DNA ligase 連接

10、，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α后PCR檢測表明連接成功，以M13為引物測序顯示重組載體中有His?Ta</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 三疣梭子蟹；Crustin；原核表達(dá)；表達(dá)載體</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　[Abstract] The first rustin identified wa

11、s an 84 amino acid protein isolated from hemocytes of the green crab （Relf et al,）,follow-up studies have shown that crustin commonly found in crustaceans,particularly at its C-terminus,where eight cysteine residues form

12、 a WAP domain. Laboratory blood lymphocytes from trituberculatus cloned cDNA library of two isomers crustin by prokaryotic expression vector of crustin between the two isomers of activity and activity differences. This s

13、tudy takes the tot</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)，屬于甲殼綱，十足目是中國沿海的重要經(jīng)濟蟹類。俗稱：梭子蟹、槍蟹、海螃蟹。分布于中國南北各海域。一般從南到北，3～5月和9～10月為生產(chǎn)旺季，渤海灣遼東半島4～5月產(chǎn)量較多。</p><p

14、>　　近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，甲殼動物養(yǎng)殖在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有極其重要的地位，但由于細(xì)菌，病毒等引起的病害也日趨嚴(yán)重，對養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失[1]。我國采用以各種抗生素來解決這問題[2]，但是大量并長期使用抗生素導(dǎo)致一些病原體細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，致使部分水產(chǎn)品中的藥物殘留物增加或嚴(yán)重超標(biāo)，威脅到食品安全同時也存在對人類的潛在威脅。由于目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素耐藥性菌種出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗生素的研發(fā)速度，而且一些抗生素只針對一部分的

15、病害，并不能抵御各類病原體的入侵。因此，急需研發(fā)與現(xiàn)有抗生素抗菌機理完全不同的新型抗菌物質(zhì)。對此，研究綠色飼料添加劑及抗感染藥劑代替抗生素成為當(dāng)前飼料添加劑領(lǐng)域的一大研究熱點[2]。</p><p>　　在甲殼類動物中，最初在食草蟹（Carcinus maenas）的血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大小為6.5kDa的富含脯氨酸的陽離子多肽[4]，還在其大顆粒血細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了大小為11.5kDa的富含半胱氨酸的疏水蛋白Carcinin

16、[5,6]，它只對革蘭氏陽性菌有抗性[7]。Destoumieux等從凡納濱對蝦(Penaeus vannanme)的血細(xì)胞和血漿中分離出幾種抗菌蛋白，其中有3種具有抗真菌和抗革蘭氏陽性菌的活性[8]。盡管抗菌肽的結(jié)構(gòu)不同，但幾乎所有抗菌肽都具有一些共同的特征[9],天然抗菌肽通常是由12-26個氨基酸組成的小分子陽離子多肽，由于富含賴氨酸，精氨酸和組氨酸等堿性氨基酸，抗菌肽通常帶有2-7個正電荷，等電點大于7，表現(xiàn)較強的陽離子特征[1

17、0]</p><p>　　Crustins是目前報道廣泛存在于甲殼類中的一類具有廣譜抗菌活性免疫因子[11]，甲殼類crustins的C末端是WAP域，該結(jié)構(gòu)在其他動物中是一個緊密的蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)。甲殼類crustins因其獨特的WAP結(jié)構(gòu)為解決蛋白質(zhì)易被蛋白酶降解，影響生物活性及保存期的問題提供了良好的基礎(chǔ)。</p><p>　　目前發(fā)現(xiàn)的Crustins均由信號肽和成熟肽兩部分組成，

18、信號肽區(qū)域長16～24 Aa，與其它類型抗菌肽如cathelicidins、defensins的保守性相比，Crustins信號肽保守性較差，而成熟肽區(qū)域相對保守些。根據(jù)信號肽與成熟肽C末端之間結(jié)構(gòu)的差別，可將Crustins分為三個亞型：I型Crustins信號肽和WAP之間存在一個序列長度多變、富含Cys的結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域中Cys的數(shù)量不超過6個，因此僅能形成一個4DSC類似結(jié)構(gòu)域，而不能形成完整的4DSC結(jié)構(gòu)域，主要存在于蟹、龍蝦

19、和螯蝦中。II型Crustins不僅有一個富含Cys結(jié)構(gòu)域，而且鄰近信號肽區(qū)還有一個大約40～80Aa的Gly富集區(qū)，主要發(fā)現(xiàn)于對蝦中。III型Crustins不僅缺乏II型的Gly富集區(qū)，而且也沒有I型和II型中的Cys富集區(qū)。</p><p>　　目前研究發(fā)現(xiàn)甲殼類通常能表達(dá)多種Crustins異構(gòu)體，這些異構(gòu)體之間通常僅相差1～4個Aa.由于Crustins異構(gòu)體在序列上差異較小，因此對活性影響可能不大，但

20、可能與不同地理群體環(huán)境的正選擇相關(guān)，同時不同的異構(gòu)體在機體中可能根據(jù)需要選擇性表達(dá)。實驗室已從三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞cDNA文庫中克隆得到Crustin的兩個異構(gòu)體，為了研究crustin這兩個異構(gòu)體之間的活性和活性差異，本研究通過構(gòu)建原核表達(dá)體系，在大腸桿菌中表達(dá)三疣梭子蟹crustins，獲得具有生物活性的重組crustins，為開發(fā)梭子蟹飼料添加劑奠定基礎(chǔ)。</p><p><b>　　材料與方法&

21、lt;/b></p><p><b>　　試劑與方法</b></p><p><b>　　材料</b></p><p>　　三疣梭子蟹購自北門菜場</p><p><b>　　培養(yǎng)基及試劑</b></p><p>　　抗凝劑（NaCl 8.2 g、

22、葡萄糖19.8 g、檸檬酸6.3 g、檸檬酸鈉7.6 g、EDTA 3.7 g，pH7.4，加蒸留水定容至1 L，121℃滅菌15 min），marine saline（NaCl 33.9 g、CaCl2 2.95 g、KCl 0.90 g、Na2HPO4 0.2 g、Tris-堿6.05 g，pH7.4，加水定容至1L，121℃滅菌15分鐘），Trizol，氯仿/異戊醇（24∶1），無水乙醇，RPE Solution，無菌RNAas

23、e-free，質(zhì)粒DNA小量制備試劑盒，Easy Pure PCR Purifiction Kit試劑盒，Easy Pure Quick Gel Extraction Kit試劑盒，pEASY-Blunt Simple Cloning Vector試劑盒，DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，LB液體培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基。</p><p><b>　　儀器</b></p><p>

24、　　PCR擴增儀（PE9700），恒溫培養(yǎng)箱；電熱恒溫水?。粶缇?；移液槍；高速離心機；恒溫?fù)u床；電泳儀（DYY-6C）；電子天平；干燥器；超凈工作臺（ZHJH-C1115C）；微生物；冷凍離心機；分光光度計等。</p><p><b>　　實驗所用引物序列</b></p><p><b>　　表1. 引物序列</b></p>&l

25、t;p>　　Table 1. primer sequence</p><p><b>　　方法</b></p><p>　　三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA的提取</p><p>　　選健康三疣梭子蟹斷肢采血10 ml，加入10 ml抗凝劑（NaCl 8.2 g、葡萄糖19.8 g、檸檬酸6.3 g、檸檬酸鈉7.6 g、EDTA 3.7 g

26、，pH7.4，加蒸留水定容至1 L，121℃滅菌15 min），3000 rpm離心5 min，棄上清，用marine saline洗滌沉淀一次（NaCl 33.9 g、CaCl2 2.95 g、KCl 0.90 g、Na2HPO4 0.2 g、Tris-堿6.05 g，pH7.4，加水定容1 L，121 ℃滅菌15分鐘），加入0.5 ml Trizol，用槍頭抽吸混勻，用1 ml針筒，6#針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA后移入1

27、.5 ml Eppendoff管（DEPC處理），加100 ul氯仿/異戊醇（24∶1），劇烈震蕩混勻30 sec，12,000 rpm室溫離心5 min，將上清液（約450 ul）轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，加150 ul無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，8,000 rpm室溫離心1 min，棄去收集管中的廢液，將柱放回收集管中，加入450 ul的RPE Solutio</p><p&g

28、t;　　目的基因的RT-PCR擴增</p><p>　　根據(jù)表達(dá)載體pET28a和實驗室克隆測定的Crustin基因cDNA核苷酸序列設(shè)計引物，引物由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成,引物序列見下表。RT-PCR實驗步驟按上海捷瑞生物技術(shù)公司AMV一步法RT-PCR試劑盒操作說明進行：</p><p><b>　　表2. 引物</b></p><p>

29、　　Table2. primer</p><p>　　1.加下列組分倒置于冰上的小離心管中。如果同時進行多個反應(yīng)可將各組分混合到一管中，然后再分到各個管中。</p><p>　　表3. PCR反應(yīng)體系</p><p>　　Table3. PCR reaction system</p><p>　　2. 輕輕混勻，可稍離心確保所有組分都在管底，

30、如需要可在上面覆一層石蠟油，然后進行熱循環(huán)。</p><p>　　3. 進行熱循環(huán)擴增：</p><p><b>　　表4. PCR梯度</b></p><p>　　Table4. PCR gradient system</p><p>　　4. 1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物。</p><p>

31、<b>　　添加接頭</b></p><p>　　1. 將下列組分加入置于冰上的小離心管中,模板為一次PCR產(chǎn)物50體系</p><p>　　表5. PCR反應(yīng)體系</p><p>　　Table5. PCR reaction</p><p>　　2. 輕輕混勻，可稍離心確保所有組分都在管底，然后進行熱循環(huán)。</p

32、><p>　　3. 進行熱循環(huán)擴增：</p><p><b>　　表6. PCR梯度</b></p><p>　　Table6. PCRgradient</p><p>　　4.1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物</p><p><b>　　擴增產(chǎn)物純化</b></p>

33、<p>　　PCR擴增產(chǎn)物的純化按Easy Pure PCR Purifiction Kit試劑盒操作</p><p>　　1. 將反應(yīng)液移至干凈的1.5 ml離心管中，加入3倍體積的Binding Buffer I 混勻</p><p>　　2. 把混合液轉(zhuǎn)移到套放于收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，離心6000 rpm，1 min</p><

34、;p>　　3. 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500 ul Wash Solution，8000 rpm，室溫離心1 min</p><p>　　4. 重復(fù)步驟3一次</p><p>　　5. 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12000 rpm室溫離心15 s</p>

35、<p>　　6. 將UNIQ-10柱放入一根新的1.5 ml離心管中，在柱子膜中央加30 ul去離子水，室溫或37℃放置2 min</p><p>　　7. 12000rpm室溫離心1 min，離心管中的液體即回收的DNA片段，儲存在-20℃。</p><p>　　目的基因片段克隆載體的構(gòu)建</p><p>　　目的基因片段克隆載體為pEASY-Blun

36、t simple vector，操作步驟按試劑盒說明書描述進行。</p><p><b>　　1. 連接</b></p><p>　　在微型離心管中依次加入溶液：</p><p>　　PCR 產(chǎn)物 0.5-4 μl，pEASY- Blunt Simple Cloning Vector 1 μl，輕輕混合后，室溫 (20 ℃-37 ℃) 反應(yīng)5分

37、鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將離心管置于冰上。</p><p><b>　　2. 轉(zhuǎn)化</b></p><p>　　(1) 加連接產(chǎn)物于50 μl E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中（在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴20-30分鐘。</p><p>　　(2) 42 ℃熱激30秒，立即置于冰上2分鐘。</p><p

38、>　　(3) 加250 μl 平衡至室溫的SOC/LB，200 轉(zhuǎn)，37 ℃孵育1小時。</p><p>　　(4) 取8 μl，500 mM IPTG，40 μl，20 mg/ml X-gal混合，均勻地涂于準(zhǔn)備好的平板上，在37 ℃放置30分鐘。</p><p>　　(5) 待IPTG，X-gal 被吸收后，取200 μl 菌液鋪板，培養(yǎng)過夜（為得到較多克隆，4000 rpm

39、離心1 min，棄掉部分上清，保留100-150 μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養(yǎng)過夜）。</p><p>　　3. PCR 方法鑒定陽性重組子</p><p>　　(1) 挑選白色克隆至10 μl 無菌水中，渦旋混合。</p><p>　　(2) 25 μl 反應(yīng)體系中取1 μl 混合液用作PCR 反應(yīng)的模板，用M13 F和M13 R鑒定重組子。</

40、p><p>　　(3) PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94 ℃變性30 秒，55 ℃退火30 秒，72 ℃延伸（ 根據(jù)片段的大小確定延伸時間）30個循環(huán)，72 ℃后延伸10 分鐘。</p><p>　　(4) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。若載體自連，通用引物擴增，自連帶大小為101 bp。</p><p><b>　　4

41、. 測序鑒定</b></p><p>　　確認(rèn)包含重組子的克隆，擴大培養(yǎng)，500 ul菌液送上海美吉生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為M13 F，T7 promoter 引物測序，進行序列分析。</p><p>　　pET-28a原核表達(dá)載體的構(gòu)建</p><p>　　克隆載體中目的基因片段的分離</p><p>　　1.克隆載體質(zhì)

42、粒提取</p><p>　　按小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒說明操作：</p><p>　?。?）挑取少量菌液劃平板（Amp 80 ug/ml），37 ℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆接種于含Amp（50 ug/ml）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃,180 rpm，培養(yǎng)過夜。（為了增加質(zhì)?？截悢?shù)，可在培養(yǎng)基變混濁后加入Cam，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h）</p><p>　?。?）在超凈工作臺上

43、，取1-2 ml過夜培養(yǎng)的菌液，12000 rpm離心1 min，棄盡上清；</p><p>　?。?）加入200 ul Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌；</p><p>　　（4）加入200 ul Solution II，立即溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的蛋清狀溶液，此步驟不宜超過5 min；</p><p>　

44、?。?）加入350 ul Solution III，溫和并充分地翻轉(zhuǎn)混合8-10次，室溫放置2-5 min，12000 rpm，10 min。</p><p>　　（6）將步驟4中的上清轉(zhuǎn)移到套放于2 ml收集管內(nèi)的Gen Clean Column中，室溫12000 rpm，1 min，取出Gen Clean Column，倒掉收集管中廢液。</p><p>　?。?）將Gen Clean

45、 Column重新放回收集管中，加入500 ul Solution IV，12000 rpm，室溫離心1 min，倒掉收集管中廢液。</p><p>　?。?）將Gen Clean Column重新放回收集管中，加入500 ul Wash Solution，12000 rpm，室溫離心1 min，倒掉廢液。</p><p>　?。?）重復(fù)步驟8一次</p><p>

46、　　（10）倒掉收集管中廢液，12000 rpm，室溫離心1 min，徹底去除Wash Solution</p><p>　?。?1）將Gen Clean Column放入干凈的1.5 ml離心管中，在Gen Clean Column膜中央加入30-50 ul去離子水，37 ℃放置2 min，12000 rpm，室溫離心1 min。離心管中的液體即為包含載體質(zhì)粒的溶液，取2-5 ul進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，-20

47、 ℃保存。</p><p><b>　　2．按下表加樣酶切</b></p><p><b>　　表7.酶切反應(yīng)</b></p><p>　　Table7. digestion reaction</p><p>　　混勻，37 ℃，過夜</p><p>　?。?）1%瓊脂糖凝膠

48、電泳檢測</p><p>　　（4）酶切產(chǎn)物純化方法同1.2.4</p><p>　　表達(dá)載體pET-28a的酶切</p><p>　　按1.2.6.1步驟2進行酶切，pET-28a載體結(jié)構(gòu)和酶切位點見圖1</p><p>　　圖1. pET-28a載體結(jié)構(gòu)示意圖</p><p>　　Fig. pET-28a vect

49、or structure digaram</p><p>　　目的片段與表達(dá)載體的連接</p><p>　　按T4 DNA Ligase說明書操作</p><p>　?。?）在微量離心管中制備下列連接反應(yīng)液</p><p><b>　　表8.連接反應(yīng)</b></p><p>　　Table8. l

50、igating reaction</p><p>　　* DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體DNA摩爾數(shù)的3～10。</p><p>　　*平滑末端的載體與DNA片段進行連接時，應(yīng)首先將載進行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化</p><p>　?。?）16 ℃過夜反應(yīng)。</p><p><b>　　轉(zhuǎn)化</b></p&g

51、t;<p>　　1.取200 ulDH-5α感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物5 ul，輕輕混勻，冰上放置30 min</p><p>　　42 ℃溫浴90 s，立即放在冰上10 min</p><p>　　加800 μl 平衡至室溫的SOC/LB，200 轉(zhuǎn)，37 ℃孵育1小時。</p><p>　　將細(xì)胞涂布于Kan+的LB平板上,在37 ℃放置30分鐘。&

52、lt;/p><p>　　pET-28a 空質(zhì)粒作對照。</p><p>　　37 ℃，過夜培養(yǎng)。</p><p>　　PCR方法鑒定陽性重組子</p><p>　　1.挑選白色克隆至10 μl 無菌水中，渦旋混合。</p><p>　　2. 5 μl 反應(yīng)體系中取1 μl 混合液用作PCR 反應(yīng)的模板，用M13 F和M13

53、 R鑒定重組子。</p><p>　　3. PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 分鐘（裂解細(xì)胞，失活核酸酶），94 ℃變性30 秒，55 ℃退火30 秒，72 ℃延伸（ 根據(jù)片段的大小確定延伸時間）30個循環(huán)，72 ℃后延伸10 分鐘。</p><p>　　4. 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。若載體自連，通用引物擴增，自連帶大小為101 bp。</p><p>

54、;　　重組表達(dá)載體的測序驗證</p><p>　　確認(rèn)包含重組子的克隆，擴大培養(yǎng)，500 ul菌液送上海美吉生物技術(shù)有限公司測序，測序引物為M13 F引物測序，進行序列分析。保留至少兩個陽性克隆繼續(xù)培養(yǎng)至菌液足夠濃后，取500 ul甘油保菌，剩余菌液按1.2.1進行質(zhì)粒提取。取1 ul電泳定量。</p><p><b>　　結(jié)果與分析</b></p>&

55、lt;p>　　三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA的提取</p><p>　　按照Trizol試劑使用說明提取三疣梭子蟹血細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計檢測，其A260 = 0.194，A280 = 0.101，RNA 純度：A260/280 = 1.93 (在正常范圍1. 8～2. 0 之間)，RNA 濃度= A260×轉(zhuǎn)換因子40 μg/ml ×稀釋倍數(shù)100 = 0.766 μg/μl

56、，滿足RACE反應(yīng)所需純度和濃度。取5 μl上樣進行RNA電泳，rRNA帶型完整，RNA未降解（圖2）。</p><p>　　圖2 三疣梭子蟹血細(xì)胞總RNA</p><p>　　Fig2. Total RNA of Portunus trituberculatus blood cells</p><p>　　RT-PCR與接頭連接</p><p&

57、gt;　　以三疣梭子蟹血淋巴細(xì)胞總RNA為模板，I型crustin引物組合：EcruS1 X EcruR1和 III型crustin 引物組合：Ecru3S1 X EcruR1，按上海捷瑞生物技術(shù)公司AMV一步法RT-PCR試劑盒操作說明進行RT-PCR，成功擴增到與預(yù)期長度一致I型和III型crustin的單一擴增帶。</p><p>　　以RT-PCR產(chǎn)物為模板，I型crustin引物組合：EcruS

58、2 X EcruR1和 III型crustin 引物組合：Ecru3S2 X EcruR1進行二次PCR，給目的基因添加腸激酶酶切位點與限制性內(nèi)切酶酶切位點，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測取得成功。</p><p>　　圖3. 目的基因PCR擴增膠圖</p><p>　　Fig3. PCR detection of the target gene</p><p><

59、;b>　　克隆載體的構(gòu)建</b></p><p>　　目的基因PCR產(chǎn)物與克隆載體質(zhì)粒pEASY-Blunt simple vector用T4 DNA ligase 連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后經(jīng)載體引物M13F/M13R擴增檢測后有目的條帶，表明克隆載體成功。菌液送上海美吉公司測序，表明挑取的克隆沒有發(fā)生變異，可用于后續(xù)表達(dá)研究（見圖A,B）。</p><p>

60、　　A. B.</p><p>　　圖4.克隆載體構(gòu)建檢測</p><p>　　Fig4.construction of cloning vector detection</p><p>　　A．克隆載體PCR檢測 B.克隆載體酶切檢測</p><p>　　A. PCR detect

61、ion of cloning vetor B. Digested cloning vector detection</p><p>　　注： 圖A：1：CruI 菌液PCR 2：CruIII 菌液PCR</p><p>　　圖B：CruI：CruI酶切 CruIII3、CruIII：CruIII酶切</p><p><b>　　表達(dá)載體的構(gòu)建

62、</b></p><p>　　目的基因克隆載體質(zhì)粒與空白表達(dá)載體質(zhì)粒pET28a分別雙酶切、割膠回收后，用T4 DNA ligase 連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后PCR檢測，表明連接成功。重組表達(dá)載體送上海美吉公司測序，測序結(jié)果表明重組表達(dá)載體質(zhì)粒沒有發(fā)生突變，預(yù)期的表達(dá)產(chǎn)物將由His?Tag、thrombin酶切位點、T7?Tag、腸激酶酶切位點與成熟目的基因組成（見圖4,5）。</p

63、><p>　　圖5 pET-28a-r CrustinI重組表達(dá)載體測序圖</p><p>　　Fig5. Recombinant expression vector pET28a-rCrustinI sequence</p><p>　　圖6 pET-28a-rCrustinIII重組表達(dá)載體測序圖</p><p>　　Fig6. Reco

64、mbinant expression vector pET28a-rCrustinIII sequence</p><p><b>　　本章小結(jié) </b></p><p>　　在本研究中，RNA的抽提、目的基因片段的RT-PCR擴增、克隆載體的構(gòu)建、表達(dá)載體的構(gòu)建均成功。</p><p><b>　　討論</b></

65、p><p>　　目前用于重組表達(dá)的系統(tǒng)可以分為兩大類：原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，不同的表達(dá)系統(tǒng)各有優(yōu)缺點，如酵母和昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)水平高，生產(chǎn)成本低，但它們的加工修飾體系與哺乳動物細(xì)胞不完全相同；哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然蛋白質(zhì)，但其表達(dá)量低、操作繁瑣。各種表達(dá)系統(tǒng)由于翻譯后的加工不完全相同，因而產(chǎn)生的重組蛋白的生物學(xué)活性和免疫原性有時會有差別。因此，選擇表達(dá)系統(tǒng)時，必須充分考慮各種因素，如所需表

66、達(dá)的蛋白質(zhì)性質(zhì)、實驗條件、生產(chǎn)成本、表達(dá)水平、安全性等，權(quán)衡利弊后再選擇相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)。</p><p>　　在現(xiàn)有關(guān)于Crustins的重組表達(dá)研究報道中，采用原核表達(dá)系統(tǒng)的居多，也有采用酵母表達(dá)系統(tǒng)（Supungul, P, 2008; Zhang, J, 2007a.b）。如Amparyup P等（2008）將黑虎蝦（Penaeus monodon）Crustin 連接如表達(dá)載體pET28b，構(gòu)建表達(dá)載體p

67、ET28b-Crus-likePm，轉(zhuǎn)化E. coli BL21-Codon Plus (DE3)-RIL成功表達(dá)，純化的rCruslikePm,對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有很強的抑菌活性，最小抑菌濃度為0.312 to 20 uM（Amparyup P，2008）。本研究中采用的表達(dá)載體pET28a與pET28b是同一系列的表達(dá)載體，只是相位不同。在研究中首先將重組表達(dá)載體pET28a-CrustinPtI和pET28a-Crustin

68、PtIII轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株E. coli BL21，但沒有檢測到表達(dá)產(chǎn)物。分析表達(dá)失敗的原因認(rèn)為極有可能是因為稀有密碼子造成的，故后又轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株Transetta，Transetta菌株中添加了稀有密碼子Arg密碼子AGG和AGA，Ile 密碼子AUA，L</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 欣華. 水產(chǎn)飼料發(fā)展趨勢. 農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù)

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