三疣梭子蟹Halloween基因克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、生物蛻皮過(guò)程受到蛻皮激素調(diào)控，Halloween基因編碼的蛋白酶在蛻皮激素合成通路中起重要作用。為了探究3個(gè) Halloween基因：spo（CYP307a1）、dib（CYP302a1）、sad（CYP315a1）在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）蛻皮調(diào)控中的作用，采用 RT-PCR和 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE），首次在三疣梭子蟹中分別克隆得到 Pt-spo基因（NCBI登錄號(hào)：KM030021

2、）、Pt-dib基因（NCBI登錄號(hào)：KM596851）、Pt-sad基因（NCBI登錄號(hào)：KM880023）。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qPCR）方法，分析3個(gè) Halloween基因在三疣梭子蟹不同組織和蛻皮周期中表達(dá)差異；利用 RNA干擾技術(shù)（RNAi），分析3個(gè) Halloween基因被沉默后下游基因表達(dá)及蛻皮激素濃度變化情況；采取眼柄切除處理（ESA），探究3個(gè) Halloween基因與蛻皮抑制激素（MIH）之間的作用關(guān)系。<

3、br>　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴克隆得到3個(gè) Halloween基因全長(zhǎng)，其中 Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad分別為2200bp、2105bp、3171bp，開(kāi)放閱讀框分別編碼520、541、553個(gè)氨基酸。經(jīng)多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，Pt-Spo與多齒新米蝦（Neocaridina denticulate）相似性最高為62％，Pt-Dib與果蠅（Drosophila melanogaster）相似性最高為40%，；Pt-Sad與多

4、齒新米蝦（N. denticulate）相似性最高為53%。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，Halloween基因編碼氨基酸分類符合生物傳統(tǒng)親緣關(guān)系，其中 Pt-dib編碼的Dib與昆蟲(chóng)的Dib聚為一大類，Pt-sad編碼的Sad與岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、果蠅（Drosophila melanogaster）等其它物種 Sad位于同一進(jìn)化分支中。Dib家族能夠與 Sad家族、S

5、hd家族匯集在一個(gè)更大的分支，構(gòu)成了細(xì)胞色素線粒體家族。Pt-spo編碼的Spo與昆蟲(chóng)的Spo都聚集在 Spo家族分支中，與Phm家族共同匯集到細(xì)胞色素第2家族中。⑵qPCR結(jié)果顯示：3個(gè)基因均在 Y器中表達(dá)量最高，與其它各組織具有顯著性差異，這表明 Halloween基因功能比較單一，與 Y器是甲殼動(dòng)物合成蛻皮激素主要器官結(jié)論一致。對(duì) Halloween基因在三疣梭子蟹蛻皮周期分析發(fā)現(xiàn)，Pt-spo表達(dá)量在 C期最高，Pt-dib在

6、D1亞期最高，Pt-sad在 D1、D2亞期表達(dá)量達(dá)到峰值。3個(gè) Halloween基因表達(dá)量高峰依次先后出現(xiàn)，與其處于蛻皮激素合成通路位置順序相一致，且表達(dá)量最高峰都早于蛻皮激素濃度峰值，可以推斷三疣梭子蟹3個(gè)Halloween基因在蛻皮調(diào)控中起重要作用。⑶RNAi實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：注射 ds-spo后，Pt-spo、Pt-dib、Pt-sad表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào);注射 ds-dib后，Pt-spo表達(dá)量無(wú)顯著變化，Pt-dib和 Pt-sa

7、d均出現(xiàn)下調(diào)；在注射 ds-sad后，Pt-sad基因表達(dá)量顯著下調(diào)，Pt-spo和 Pt-sad則無(wú)顯著變化。對(duì)分別注射3個(gè) Halloween基因 dsRNA的三疣梭子蟹抽取血淋巴，測(cè)定蛻皮激素濃度發(fā)現(xiàn)，spo組沒(méi)有顯著性變化，dib和 sad組與對(duì)照組相比顯著降低。表明3個(gè)Halloween基因在蛻皮激素合成的調(diào)控中可能存在級(jí)聯(lián)關(guān)系。⑷眼柄切除（ESA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Pt-dib和 Pt-sad表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度上升。其中 Pt