三疣梭子蟹蛻皮抑制激素基因的組織表達(dá)【畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　三疣梭子蟹蛻皮抑制激素基因的組織表達(dá)</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí)

2、生物技術(shù) </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目　錄</b&g

3、t;</p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料與方法2</b></p><p>　　2.1實(shí)驗(yàn)材料2</p><p>　　2.2實(shí)驗(yàn)試劑和引物2</p><p>　　2.3主要儀器2</p><p

4、>　　2.4總RNA的提取2</p><p>　　2.5第一鏈cDNA合成3</p><p>　　2.6熒光定量PCR4</p><p>　　2.7相對(duì)定量處理4</p><p><b>　　3結(jié)果與分析4</b></p><p>　　3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4</p&g

5、t;<p>　　3.1.1獲得總RNA結(jié)果4</p><p>　　3.1.2熒光定量PCR處理結(jié)果5</p><p>　　3.1.3相對(duì)定量法處理結(jié)果6</p><p><b>　　3.2討論8</b></p><p><b>　　4展望10</b></p&g

6、t;<p>　　致謝錯(cuò)誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)10</b></p><p>　　摘 要：甲殼動(dòng)物的蛻皮過(guò)程主要是由兩種激素相互拮抗而進(jìn)行調(diào)控的，分別是由Y器分泌的蛻皮類固醇激素和由X器-竇腺?gòu)?fù)合體分泌的蛻皮抑制激素（MIH），其中MIH抑制Y器中蛻皮激素的合成從而抑制蛻皮。MIH是其中一個(gè)重要激素，和血糖過(guò)多激素（CHH

7、）、性腺抑制激素（GIH）組成了一個(gè)新的甲殼動(dòng)物的神經(jīng)肽家族，本文通過(guò)熒光定量PCR對(duì)三疣梭子蟹MIH基因的組織表達(dá)進(jìn)行研究，然后用相對(duì)定量法進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MIH在X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器中都能表達(dá)，但是和X器-竇腺?gòu)?fù)合體相比，其他組織MIH的表達(dá)量極低。。</p><p>　　關(guān)鍵詞：三疣梭子蟹；蛻皮抑制激素；甲殼動(dòng)物；X器-竇腺?gòu)?fù)合體。</p><p>

8、;　　Abstract：The process of ecdysis of crustaceans is an antagonistic interaction by two hormone. They were ecdysone originates from the Y-organ and the molting inhibition hormone (MIH) originates from X-organ/sinus gland

9、 (XO/SG) complex, respectively. Among them MIH inhibits the synthesis of ecdysteroids by Y-organs. MIH is an important hormone, together with crustacean hyperglycemic hormone (CHH) and gonad inhibiting hormone (GIH), the

10、y constitute a novel family of related peptides. This article i</p><p>　　Keywords: Portunus trituberculatus；molt-inhibiting hormone；crustacean；X-Organ Sinus Gland Complex。</p><p><b>　　引言&l

11、t;/b></p><p>　　三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus），屬于甲殼綱梭子蟹科，是我國(guó)沿海地區(qū)的一種重要經(jīng)濟(jì)蟹類。因?yàn)樗纳L(zhǎng)迅速，再加上養(yǎng)殖利潤(rùn)豐厚，它已經(jīng)漸漸成為中國(guó)沿海地區(qū)一種重要的養(yǎng)殖品種。三疣梭子蟹一般在3-5米深海底生活及繁殖，冬天它會(huì)移居到10-30米的深海中，它喜歡穴居在泥沙底部。近年來(lái)，隨著各種蝦蟹類在市場(chǎng)上需求的擴(kuò)大和人們對(duì)蝦蟹的過(guò)度捕撈，現(xiàn)有三疣梭子

12、蟹的人工養(yǎng)殖也不能完全滿足市場(chǎng)的需求。另一方面，人工養(yǎng)殖的三疣梭子蟹會(huì)出現(xiàn)抱卵過(guò)早[1]、蛻皮未遂[2]等問(wèn)題。這些問(wèn)題增加了三疣梭子蟹的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，制約了三疣梭子蟹市場(chǎng)的擴(kuò)大。</p><p>　　在甲殼動(dòng)物中，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)儀器、技術(shù)的改進(jìn)，對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控及其功能的研究越來(lái)越多，但是仍然不能有效的解決養(yǎng)殖中普遍存在的性早熟和蛻皮未遂等難題。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，這些問(wèn)題可能與甲殼動(dòng)物的蛻皮機(jī)制密切相關(guān)。[2] 所以研究

13、清楚蛻皮機(jī)制對(duì)解決三疣梭子蟹存在的問(wèn)題具有很重要的意義。</p><p>　　Zelony通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了眼柄在蟹的蛻皮周期中發(fā)生作用，它可以使蛻皮間期縮短從而促進(jìn)蛻皮，然后他們推測(cè)眼柄中肯定存在一種蛻皮抑制因子。在眼柄切除后，不僅僅使蛻皮周期縮短，同樣產(chǎn)生了一些其他的生理生化反應(yīng)，比如對(duì)生長(zhǎng)和性腺發(fā)育產(chǎn)生影響。[17,18]所以我們可以推測(cè)在蟹的眼柄中肯定存在多種激素來(lái)調(diào)節(jié)它的生理生化反應(yīng)。眼柄中的X器、Y器、大

14、顎器都可以分泌一定的激素來(lái)影響蟹的生長(zhǎng)發(fā)育。</p><p>　　由X器-竇腺?gòu)?fù)合體合成和分泌的MIH蛻皮抑制激素被認(rèn)為是甲殼動(dòng)物中涉及蛻皮控制的一個(gè)重要激素。現(xiàn)在的一個(gè)普遍接受的看法是：甲殼動(dòng)物的蛻皮過(guò)程主要是由兩種激素相互拮抗而進(jìn)行調(diào)控的，分別是由Y器分泌的蛻皮類固醇激素和由X器-竇腺?gòu)?fù)合體分泌的MIH，而且MIH抑制Y器中蛻皮激素的合成從而抑制蛻皮。Watson 在2001年通過(guò)研究證明了這個(gè)觀點(diǎn)。所以MI

15、H在甲殼動(dòng)物的蛻皮中起著非常重要的作用。</p><p>　　MIH的合成部位是甲殼動(dòng)物的眼柄中的X-器官，然后運(yùn)送到竇腺中貯存并且由竇腺釋放。近年來(lái)，通過(guò)從對(duì)MIH的研究可以發(fā)現(xiàn)，切除甲殼類動(dòng)物眼柄就能有效的促進(jìn)蛻殼和性腺的早期發(fā)育，而對(duì)上述手術(shù)后的動(dòng)物重新注入眼柄分泌物或者M(jìn)IH后，會(huì)使蛻皮激素濃度降低，同時(shí)推遲蛻皮。[19]</p><p>　　近些年來(lái)，甲殼動(dòng)物十足目中有很多物種的

16、MIH序列已經(jīng)被測(cè)定，例如凡納對(duì)蝦、刀額新對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、黃道蟹等。對(duì)甲殼動(dòng)物在蛻皮周期時(shí)在眼柄內(nèi)編碼產(chǎn)生的MIH進(jìn)行Northem印跡，我們可以發(fā)現(xiàn)編碼MIH的mRNA水平在蛻皮前期逐漸降低，最低點(diǎn)出現(xiàn)在蛻皮晚前期，在蛻皮后水平突然升高，在蛻皮間期持續(xù)升高，從而說(shuō)明了MIH的生理功能。[12] 現(xiàn)在甲殼類動(dòng)物蛻皮的發(fā)生與MIH之間的關(guān)系還沒有取得共識(shí)，MIH基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理還沒有得到闡明。所以研究更多的甲殼動(dòng)物MIH是非常必要的。&l

17、t;/p><p>　　當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外都有對(duì)蟹類MIH基因研究的報(bào)道，王在照等利用RT-PCR得到鷹爪蝦（Trachypenaeus curvirostris）MIH片段[4]，并對(duì)中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）蛻皮抑制激素基因的cDNA片段進(jìn)行克隆和序列分析[10]；他們運(yùn)用還采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)方法，首次得到中國(guó)對(duì)蝦蛻皮抑制激素的全長(zhǎng)cDNA；宋霞等運(yùn)用反向PCR技術(shù)得到了中華絨螯

18、蟹的蛻皮抑制激素1基因組DNA序列[5]；邱高峰等用RT-PCR技術(shù)首次擴(kuò)增獲得鋸緣青蟹(Scylla serrata)編碼MIH成熟肽的全長(zhǎng)cDNA序列及部分信號(hào)肽序列[6]；朱冬發(fā)等對(duì)三疣梭子蟹蛻皮抑制激素的cDNA進(jìn)行克隆與序列分析[7]；Lee等人對(duì)可口美青蟹蛻皮周期中MIH的mRNA水平和蛻皮激素濃度的變化進(jìn)行觀察和分析[11]。雖然有對(duì)三疣梭子蟹MIH有一定的報(bào)道，但是相關(guān)的研究還是很少的。本研究通過(guò)對(duì)三疣梭子蟹MIH基因在

19、不同組織中表達(dá)的分析，為今后更深入地研究MIH的功能奠定基礎(chǔ)。</p><p>　　在對(duì)MIH基因在不同物種的不同組織中的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，在眼柄中MIH基因的表達(dá)量較高，而且在一些甲殼動(dòng)物的腦中也可以發(fā)現(xiàn)MIH基因少量表達(dá)[13]，然后在精巢、卵巢、肝胰腺和肌肉等組織中發(fā)現(xiàn)沒有表達(dá)[14、15]。除了這些器官的研究，Lu等用巢式PCR對(duì)食用黃道蟹（Cancer pagurus）中其他器官的MIH基因的組織表達(dá)進(jìn)行研

20、究，發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)、腹神經(jīng)索和胸部或腹部的神經(jīng)節(jié)都有MIH基因的表達(dá)[16]。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PrimeScript RT reagent Kit說(shuō)明書上的方法獲得X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器中MIH基因的cDNA的一條鏈，然后用熒光定量PCR法測(cè)定竇各個(gè)實(shí)驗(yàn)器官中的RNA含量，即MIH基因的表達(dá)量。以X器-竇腺?gòu)?fù)合體的數(shù)據(jù)作為對(duì)照組，然后用2 - △△Ct方法進(jìn)行相對(duì)定量

21、。最后用圖表定量的說(shuō)明各個(gè)器官中MIH基因的表達(dá)情況。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)材料</b></p><p>　　在寧波寧海長(zhǎng)街得水育苗場(chǎng)購(gòu)得三疣梭子蟹。選取生長(zhǎng)旺盛體重在40-80g之間，頭胸甲寬為8-12cm之間的三疣梭子蟹，然后取分別取出X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神

22、經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器組織，取出后迅速轉(zhuǎn)移到液氮中保存。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)試劑和引物</b></p><p>　　DEPC（RNase Free），Trizol，購(gòu)自Sangon公司(加拿大) ；SYBR Premix Ex Taq II，PrimeScript RT reagent Kit，DNase I（RNase Free），引物合成是由

23、上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)完成；從Takara公司(日本)購(gòu)得試劑盒。</p><p><b>　　主要儀器</b></p><p>　　T-1 Thermocycler PCR自動(dòng)系列化分析儀：德國(guó)Biometra公司；</p><p>　　MICROMAX常溫離心機(jī)；美國(guó)Thermo公司；</p><

24、;p>　　REVCD 1386-3V型超低溫冰箱：美國(guó)REVCD公司；</p><p>　　HZ-9211K恒溫振蕩器：太倉(cāng)市科教器材廠；</p><p>　　DYY-8B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀：北京六一儀器廠；</p><p>　　Biofuge fresco高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：美國(guó)SORVALL公司；</p><p>　　吉爾森可調(diào)精密移

25、液器PEPETMAN：法國(guó)GILSON公司；</p><p>　　TL988型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀；</p><p><b>　　總RNA的提取</b></p><p>　?。?） 超低溫冷凍總RNA提取樣品，稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，期間不斷加入液氮直至研磨成粉狀；</p><p>　?。?） 向研缽中加入適

26、量mRNA Reagant將粉末狀的樣品覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，要用研缽繼續(xù)研磨至透明狀；</p><p>　?。?） 將勻漿液移至離心管中，室溫靜置50min；</p><p>　?。?） 在4℃，12000轉(zhuǎn)的條件下離心5min；</p><p>　?。?） 小心吸取上清液，移入新離心管中；</p><p>　?。?） 將上

27、述離心液加入200μL氯仿，震蕩，待充分乳化至乳白狀，靜置5min；</p><p>　?。?） 在4℃，12000轉(zhuǎn)的條件下離心15min；</p><p>　?。?） 吸取上清液300μL-400μL移至新的離心管中；</p><p>　　（9） 向上清液中加入等體積的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，在15℃-30℃靜置10min；</p><p&

28、gt;　?。?0）在4℃，12000轉(zhuǎn)的條件下離心10min；</p><p>　　（11） 棄上清液，緩慢沿管壁加入75%乙醇1000μL，輕輕上下顛倒洗滌，離心管壁，在4℃，12000轉(zhuǎn)的條件下離心5min，后棄乙醇，干燥2-5min；</p><p>　?。?2） 加入適量RNase-free H2O（大約20-50μL）</p><p><b>　

29、　第一鏈cDNA合成</b></p><p>　　基因組DNA的除去反應(yīng)</p><p>　　42℃下2 min（或者室溫5 min*2）</p><p><b>　　4℃保存</b></p><p><b>　　反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)</b></p><p>　　在冰上進(jìn)行

30、反應(yīng)物的配置。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，進(jìn)行各項(xiàng)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+1的量配制Master Mix，然后再分裝到每個(gè)反應(yīng)管中*3。</p><p>　　37℃下15 min*6</p><p><b>　　85℃下5 sec</b></p><p><b>　　4℃*7下保存</b></p><p&

31、gt;　　*1 在20 μl的反應(yīng)體系中可以使用的最大Total RNA是1 μg。 </p><p>　　*2 如果反應(yīng)在室溫下進(jìn)行時(shí)時(shí)，可以將時(shí)間延長(zhǎng)至30分鐘。 </p><p>　　*3 不配制Master Mix，把添加劑加入①的反應(yīng)液中時(shí)，要先加入RNase Free dH2O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)，將它們混合后

32、再加入RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I，然后輕輕混勻混合液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 </p><p>　　*4 使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇性的使用RT Primer Mix，也可以選擇Oligo dT Primer或Gene Specific Primer進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，引物使用量如下：Oligo dT Primer

33、50 pmol／20 μl反應(yīng)體系；Gene Specific Primer 5 pmol／20 μl反應(yīng)體系 。</p><p>　　*5 根據(jù)不同的需求相應(yīng)的擴(kuò)大反應(yīng)體系。 </p><p>　　*6 在使用Gene Specific Primer時(shí)，建議將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為42℃下轉(zhuǎn)錄15 min。如果在PCR反應(yīng)中有非特異性 片段擴(kuò)增時(shí)，可以將溫度升到50℃，這樣會(huì)對(duì)反轉(zhuǎn)錄有一定

34、的改善。 </p><p>　　*7 合成的cDNA需要長(zhǎng)時(shí)間保存時(shí)，請(qǐng)于-20℃保存。</p><p><b>　　熒光定量PCR</b></p><p>　　在Mastercycler ep realplex real-time PCR (Eppendorf)上完成熒光定量PCR，總共25 μL PCR的反應(yīng)體系，里面包含SYBR Prem

35、ix Ex Taq II(2×)緩沖液12.5 μL，正向和反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL（參見表1），dH2O 10.5 μL，cDNA模板1 μL。步驟是現(xiàn)在為95 ℃ 保持30 s，進(jìn)行一個(gè)循環(huán)，隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)包括：95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s。PCR結(jié)束后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，以確保特異性擴(kuò)增，條件是95 ℃ 30 s，55 ℃ s，95 ℃ 15 s(1個(gè)

36、循環(huán))，從55 ℃上升到95 ℃的過(guò)程耗時(shí)20min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用儀器自帶程序讀取。</p><p>　　表 1 內(nèi)參基因與目的基因的引物序列</p><p>　　Table 1 Primer sequences for internal control genes and targeted genes</p><p><b>　　相對(duì)定量處理</b

37、></p><p>　　我們采用2 - △△Ct方法做相對(duì)定量，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組 ，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組目的基因的相對(duì)表達(dá)量。把18S rRNA作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品平均分析兩次取平均值。把X器-竇腺?gòu)?fù)合體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。然后根據(jù)數(shù)據(jù)作柱狀分析圖。</p><p><b>　　結(jié)果與分析 </b

38、></p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果</b></p><p><b>　　獲得總RNA結(jié)果</b></p><p>　　在本次實(shí)驗(yàn)中我們進(jìn)行Genomic DNA污染的去除，因?yàn)榇朔椒梢杂行У墨@得MIH總RNA，（見圖1）, 總RNA濃度為：768~1158ng/μl, OD260/280值為1.80~2.05

39、。</p><p>　　圖1 總RNA凝膠電泳圖</p><p>　　Fig.1 Result of total RNA after electrophoresis in 1% agrose gel</p><p>　　圖中電泳條下面的數(shù)字代表不同的組織，我們選取了四個(gè)組織的總RNA跑帶，分別是：X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢。根據(jù)圖1我們可以看出凝膠電

40、泳跑出的條帶較清晰，降解較低。然后我們測(cè)其OD260/280值來(lái)確定其適宜性。凝膠電泳測(cè)得總RNA含量和OD260/280值見下表。</p><p>　　表2 總RNA含量和OD260/280值</p><p>　　Table 2 The content of total RNA and OD260/280 values</p><p>　　由表2可以看出，總RNA

41、含量達(dá)標(biāo)，而且純度也比較高，所以所提取的總RNA滿足實(shí)驗(yàn)條件，可以進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。</p><p>　　熒光定量PCR處理結(jié)果</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，以18s和actin為內(nèi)參基因，對(duì)MIH基因在三疣梭子蟹不同組織中的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行了研究，各組樣品在熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，最后得到了反映核酸擴(kuò)增過(guò)程的S形熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線。見圖3。</p&

42、gt;<p>　　圖3擴(kuò)增曲線動(dòng)力學(xué)分析</p><p>　　Fig.3 The analysis of amplification plot</p><p>　　圖3表示不同實(shí)驗(yàn)組織和內(nèi)參基因在熒光定量PCR中達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)，自左向右分別表示：Y器、精巢、腦、腸、卵巢、X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神經(jīng)節(jié)、actin基因、18S基因。達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)越多，Ct值越小。

43、</p><p><b>　　圖4溶解曲線</b></p><p>　　Fig.4 Fusion curve</p><p>　　從圖4可以看出：熒光定量動(dòng)力學(xué)曲線基線平整，擴(kuò)增曲線比較理想。各基因樣品熔解曲線都會(huì)有一個(gè)比較整齊的峰值，基線平整，熔解溫度較均一，峰的形狀也比較銳利。說(shuō)明產(chǎn)物擴(kuò)增具有特異性。</p><p>

44、;　　從圖4中分離出MIH的溶解曲線，見圖5。從圖5中看出熔解曲線的峰值比較完整，而且熔解度為87.5左右。</p><p>　　圖5 MIH基因的溶解曲線</p><p>　　Fig.5 Fusion curve of MIH gene</p><p><b>　　相對(duì)定量法處理結(jié)果</b></p><p>　　表3

45、相對(duì)定量處理結(jié)果（18S為內(nèi)參基因）</p><p>　　Processing results of Comparative Delta-delta Ct (reference gene is 18S)</p><p>　　圖6 MIH基因mRNA在各個(gè)實(shí)驗(yàn)器官中的相對(duì)表達(dá)量（18S為內(nèi)參基因）</p><p>　　Fig.6 Comparative express

46、ion level of MIH gene in experimental organs (reference gene is 18S)</p><p>　　根據(jù)表3中的2- △△Ct做柱狀圖，得到圖6，圖6中的數(shù)字代表的含義：1、X器-竇腺?gòu)?fù)合體；2、胸腹神經(jīng)節(jié)；3、精巢；4、卵巢；5、腸；6、腦；7、Y器。</p><p>　　表4 相對(duì)定量處理結(jié)果（actin為內(nèi)參基因）</p

47、><p>　　Processing results of Comparative Delta-delta Ct (reference gene is actin)</p><p>　　圖7 MIH基因mRNA在各個(gè)實(shí)驗(yàn)器官中的相對(duì)表達(dá)量（actin為內(nèi)參基因）</p><p>　　Fig.7 Comparative expression level of MIH ge

48、ne in experimental organs (reference gene is actin)</p><p>　　根據(jù)表4中的2- △△Ct做柱狀圖，得到圖7，圖7中的數(shù)字代表的含義：1、X器-竇腺?gòu)?fù)合體；2、胸腹神經(jīng)節(jié)；3、精巢；4、卵巢；5、腸；6、腦；7、Y器。</p><p>　　根據(jù)圖6和圖7中可以看出在X器-竇腺?gòu)?fù)合體、胸腹神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦、Y器都有一定的表

49、達(dá)。當(dāng)以actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，三疣梭子蟹的MIH基因以X器-竇腺?gòu)?fù)合體為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組時(shí)，胸腹神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、腸、腦和Y器中MIH基因表達(dá)量都比對(duì)照組少，且精巢和腸中幾乎檢測(cè)不到MIH的表達(dá)量。X器-竇腺?gòu)?fù)合體的MIH基因表達(dá)量是胸腹神經(jīng)節(jié)表達(dá)量的12倍左右，是卵巢中MIH基因表達(dá)量3.4倍左右。當(dāng)以18S為內(nèi)參基因的時(shí)候，除胸腹神經(jīng)節(jié)外，包括卵巢在內(nèi)的MIH基因表達(dá)量都非常低。</p><p><b&

50、gt;　　討論</b></p><p>　　目前的研究發(fā)現(xiàn)在不同的物種間相同組織MIH基因的表達(dá)情況也不一樣。有些物種在神經(jīng)系統(tǒng)中能夠表達(dá)，比如日本囊對(duì)蝦、鋸緣青蟹、刀額新對(duì)蝦、可口美青蟹和銹斑蟳在胸神經(jīng)節(jié)和腦中有表達(dá)[6,13,16]，但是在凡納濱對(duì)蝦中就只發(fā)現(xiàn)在眼柄中有表達(dá)，而在胸神經(jīng)節(jié)和腦中沒有表達(dá)[15]。</p><p>　　對(duì)三疣梭子蟹MIH基因組織表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，

51、其與大部分的蝦蟹一樣，在腦和胸神經(jīng)節(jié)中都有表達(dá)。在X器-竇腺?gòu)?fù)合體、精巢、卵巢、腸、Y器中也有表達(dá)，但是與X器-竇腺?gòu)?fù)合體相比，其他組織中MIH基因的表達(dá)量都很低。</p><p>　　分析原因可能是與在其他蟹類中的研究有差異，原因可能是蟹類品種不同所致，也有可能是取的三疣梭子蟹的特異性的原因。因?yàn)槲覀內(nèi)〔牡男奉惒皇峭懫ぶ芷谥械娜嗨笞有?，而MIH最主要的作用是作用于Y器抑制蛻皮激素的產(chǎn)生從而抑制蛻皮，所以在非蛻

52、皮時(shí)期，其他組織中的MIH含量低也是可能發(fā)生的。</p><p>　　而且相對(duì)定量法得到的數(shù)據(jù)結(jié)果會(huì)有一定的誤差，因?yàn)橄鄬?duì)定量法假設(shè)PCR的擴(kuò)增效率為1，但是實(shí)際上的擴(kuò)增效率達(dá)不到1。而且和絕對(duì)定量法比較，精確性不是很高。不過(guò)絕對(duì)定量法非常的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，會(huì)大大的降低定量的效率，會(huì)增加其難度。</p><p>　　作為三疣梭子蟹體內(nèi)貯存MIH的器官，X器-竇腺?gòu)?fù)合體對(duì)MIH有非常重要的作用，它

53、貯藏X器官神經(jīng)分泌細(xì)胞所產(chǎn)生的神經(jīng)分泌物，并釋放到血液中，是一個(gè)神經(jīng)分泌系的末梢貯藏放出器。在X器中生成的MIH，可通過(guò)神經(jīng)軸索而進(jìn)入X器-竇腺?gòu)?fù)合體。所以我們把X器-竇腺?gòu)?fù)合體中MIH的表達(dá)量作為本次實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。</p><p>　　有研究表明，鋸緣青蟹的胸神經(jīng)團(tuán)和促雄腺具有直接的神經(jīng)聯(lián)系，也就是說(shuō)鋸緣青蟹促雄腺和胸神經(jīng)團(tuán)及相連的眼柄神經(jīng)節(jié)等必然有著直接的相互作用關(guān)系。而且在神經(jīng)器官對(duì)性腺發(fā)育的作用的研究中發(fā)

54、現(xiàn)：腦和胸神經(jīng)團(tuán)對(duì)精巢發(fā)育也有一定的作用。可能原因是鋸緣青蟹德的腦和胸神經(jīng)團(tuán)分泌的促性腺激素（GSH）先作用在促雄腺上，然后分泌促雄腺激素(AGH)，接著再作用于精巢，間接促進(jìn)精巢發(fā)育。[24]三疣梭子蟹中MIH基因在胸神經(jīng)節(jié)和大腦中的表達(dá)可能說(shuō)明MIH也許和性腺發(fā)育相關(guān)。而表達(dá)量的差異也許與他們的作用大小有關(guān)。</p><p>　　胸神經(jīng)團(tuán)和促雄腺具有直接的神經(jīng)聯(lián)系，而且促雄腺對(duì)精巢發(fā)育有促進(jìn)作用，其中的主要原

55、因可能是增加了精子數(shù)，從而加快了精莢形成的速度。沈建明等的研究表明，MIH可能與即將排出體外的精莢存在一定的聯(lián)系。[21]本次實(shí)驗(yàn)在精巢和胸神經(jīng)節(jié)中都發(fā)現(xiàn)了MIH的表達(dá)，而且在胸神經(jīng)節(jié)中表達(dá)量很高，我們可以推測(cè)MIH與即將排出體外的精莢存在一定的聯(lián)系。當(dāng)然，在這一方面我們還需要更多的研究來(lái)探究它們之間的聯(lián)系。</p><p>　　羅榮生等用20-羥蛻皮酮注射中華絨螯蟹發(fā)現(xiàn)有刺激卵巢增重的作用[25]，說(shuō)明蛻皮固酮

56、對(duì)卵巢有作用，而作為蛻皮激素拮抗的蛻皮抑制激素，在卵巢中也應(yīng)該表達(dá)。推測(cè)也有可能是兩種激素的拮抗作用引發(fā)了卵巢增重。</p><p>　　沈建明等的研究沒有發(fā)現(xiàn)MIH基因在Y器中的表達(dá)[21]，但是本次實(shí)驗(yàn)中在Y器中發(fā)現(xiàn)了MIH基因的表達(dá)。而且我們可以從圖6和圖7中看出Y器中的表達(dá)量很小。分析原因可能是本次實(shí)驗(yàn)用了熒光定量PCR，可以測(cè)量微量的表達(dá)量。Y器作為MIH作用的靶器官，雖然實(shí)驗(yàn)材料不是在蛻皮期，但是也會(huì)

57、有一定的表達(dá)量，說(shuō)明MIH不只是在三疣梭子蟹蛻皮的時(shí)候進(jìn)入Y器的。</p><p>　　在內(nèi)參基因的選擇上，由表3我們看出當(dāng)以18S為內(nèi)參基因時(shí)，X器-竇腺?gòu)?fù)合體不適合做組織差異表達(dá)，由表4看出當(dāng)以actin為內(nèi)參基因時(shí)，腸不適合做組織差異表達(dá)。而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不管以18S作為內(nèi)參基因還是以actin為內(nèi)參基因，當(dāng)X器-竇腺?gòu)?fù)合體中MIH基因的表達(dá)量作為對(duì)照后，其他組織中MIH基因的表達(dá)量都很低。</p&

58、gt;<p>　　總之，相對(duì)定量的精確性有待探討，但是這不影響其精確測(cè)定組織中基因的表達(dá)與否，像在本實(shí)驗(yàn)中就發(fā)現(xiàn)在Y器中有MIH基因的表達(dá)。另一方面，MIH的表達(dá)在各種蟹類中都不同，在三疣梭子蟹中的組織表達(dá)也沒有研究透徹，本次實(shí)驗(yàn)探索性的用熒光定量PCR后的相對(duì)定量來(lái)研究三疣梭子蟹MIH基因的組織差異表達(dá)，為以后研究MIH在三疣梭子蟹在各個(gè)組織中的表達(dá)打下理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為在體外表達(dá)具有活性的MIH蛋白提供便利。</

59、p><p><b>　　展望</b></p><p>　　隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，甲殼動(dòng)物MIH的調(diào)控機(jī)制將會(huì)得到不斷地驗(yàn)證與完善。針對(duì)甲殼動(dòng)物更多的物種進(jìn)行研究對(duì)于完善整個(gè)調(diào)控機(jī)制是至關(guān)重要的。近些年來(lái)，由于生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的成功應(yīng)用，甲殼動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的研究取得了很大進(jìn)展。但目前其研究對(duì)象主要局限于幾種模式動(dòng)物，例如，普通濱蟹、美洲龍蝦、泥污鯨螯蝦和原螫

60、蝦等，而對(duì)其它動(dòng)物研究較少。直到如今在生產(chǎn)上仍然采用傳統(tǒng)的方法如切除眼柄、注射脊椎動(dòng)物激素等調(diào)節(jié)一些經(jīng)濟(jì)種類的生殖活動(dòng)，所以我們應(yīng)該擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)物種和實(shí)驗(yàn)方法。例如可以使用神經(jīng)肽多克隆或單克隆抗體和分子生物學(xué)探針等。</p><p>　　而且大多數(shù)激素在細(xì)胞內(nèi)分子水平上的調(diào)控機(jī)制尚未完全清楚，如內(nèi)分泌激素在細(xì)胞內(nèi)的受體、與靶器官的作用模式、對(duì)靶器官合成通路上的酶的調(diào)控、在血淋巴中的半衰期、在不同的環(huán)境條件下及生活周期

61、的不同階段，釋放激素的精確含量等。</p><p>　　當(dāng)然，對(duì)MIH的研究的進(jìn)展必然會(huì)給我們帶來(lái)巨大的現(xiàn)實(shí)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　劉昌杰, 侯艷麗, 王緯等. 蝦池養(yǎng)殖三疣梭子蟹當(dāng)年性早熟初報(bào)[J]. 齊魯漁業(yè), 1999(16): 19~20. </p><p&

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