雜合抗菌肽HMCM的原核表達(dá)及其抗菌活性的初步鑒定.pdf

1、抗菌肽是一類帶正電荷的兩親性小分子肽的總稱，具有抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)?？咕膩碓磸V泛，分類多樣，且生物活性很強(qiáng)，在醫(yī)藥、畜牧業(yè)以及食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
　　雜合抗菌肽是基因工程技術(shù)產(chǎn)物之一，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽具有用時(shí)短、含量高等優(yōu)點(diǎn)。雜合抗菌肽主要是由兩種或多種抗菌肽的部分功能肽鏈拼接組成，具有廣譜、低毒以及高效等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，改造的抗菌肽具有與藍(lán)本相似甚至更強(qiáng)的生物活性，并且毒副作用降低，具有非常大的研究價(jià)值

2、。
　　本研究擬將哺乳動(dòng)物抗菌肽（Hexapeptide）、兩棲類抗菌肽（Magainin）、昆蟲抗菌肽（CecropinA和Melittin）的有效作用部分拼接在一起，以獲得一種新型的雜合抗菌肽HMCM。本研究根據(jù)目的抗菌肽HMCM的氨基酸序列和大腸桿菌B細(xì)胞的密碼子偏好性設(shè)計(jì)了目的蛋白HMCM的基因序列，并對(duì)HMCM的生物信息學(xué)進(jìn)行分析；設(shè)計(jì)了三條引物通過兩輪PCR反應(yīng)獲得目的基因，將目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET-32a-

3、c(+)構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-32a-HMCM；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)實(shí)現(xiàn)融合表達(dá)，通過摸索誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度、OD600和溫度等條件確定了融合蛋白表達(dá)的最佳條件，并確定了融合蛋白以可溶形式存在；通過親和層析快速純化了融合蛋白，并進(jìn)行了Western-blotting鑒定；最后用EK酶酶切融合蛋白釋放出HMCM，對(duì)HMCM的抗菌性進(jìn)行了初步分析。
　　本研究獲得的主要成果如下：
　　

4、①生物信息學(xué)分析表明，HMCM具有抗菌肽的基本性質(zhì)：分子量大小為4.07kD，等電點(diǎn)pI為12.805；N端親水，C端疏水；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋結(jié)構(gòu)，含有少量的β折疊結(jié)構(gòu)、β轉(zhuǎn)角以及無規(guī)則卷曲。
　?、诮?jīng)兩輪PCR反應(yīng)獲得了編碼HMCM的基因片段，并克隆到經(jīng)KpnI和EcoRI酶切的原核表達(dá)載體pET-32a-c(+)，獲得了重組表達(dá)載體pET-32a-HMCM。
　?、蹖?shí)現(xiàn)了融合蛋白在表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)

5、中的試表達(dá)以及表達(dá)條件的優(yōu)化。最終優(yōu)化的表達(dá)條件為：誘導(dǎo)時(shí)間3h，誘導(dǎo)初始OD600=0.9左右，誘導(dǎo)IPTG濃度為0.8mmol/L，誘導(dǎo)溫度為30℃。
　?、艹暡ㄆ扑閷?shí)驗(yàn)表明，融合蛋白以可溶形式存在于菌體上清中。超濾濃縮上清液，親和層析純化后獲得了單一的目的條帶，并進(jìn)行了Western-blotting鑒定。
　?、莸鞍诐舛葴y定結(jié)果表明，融合蛋白的表達(dá)水平達(dá)到了毫克級(jí)，每升培養(yǎng)液可生產(chǎn)11.92mg融合蛋白。