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文檔簡介
1、中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國土生土長的蜂種,其抗病性明顯優(yōu)于西方蜜蜂(Apismellifera)。蜂王漿是哺育工蜂的咽下腺、上顎腺和腦后腺等腺體分泌的乳狀、具有生物活性的活性物質(zhì)。近期的研究表明,中華蜜蜂抗病性優(yōu)于西方蜜蜂以及蜂王漿不易變質(zhì)的特性都與中華蜜蜂王漿抗菌肽Apis cerana cerana—royalisin(Acc—royalisin)有關(guān)。Prepro—Acc—royalisn(PPAR)是
2、Acc—royalisin前體,Mature Acc—royalisin(MAR)為Acc—royalisin的成熟肽部分。
1.Prepro—Acc—royalisn原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
以含蜂王漿抗菌肽Prepro—Acc—royalisn(PPAR)基因的中華蜜蜂頭部cDNA文庫質(zhì)粒為模板,用PCR方法擴(kuò)增出其前體片段,將該片段克隆入表達(dá)載體pGEX—4T—2,其C端與GST連接。在大腸桿菌BL2
3、1中與GST進(jìn)行融合表達(dá)。利用割膠回收獲得目的蛋白注射兔子,制備多克隆抗體。SDS—PAGE和薄層掃描分析結(jié)果表明:該基因得到高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物大小約為46kDa,占細(xì)胞總蛋白的16.3%。利用所獲抗體對純化PPAR融合蛋白進(jìn)行Western blot印跡分析,獲得特異性條帶。結(jié)果證明,該抗體可用于檢測Acc—royalisin的存在。
2.Mature Acc—royalisin的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物可溶性分析
4、 本試驗(yàn)完成了對Mature Acc—royalisin(MAR)的基因克隆、原核表達(dá)及產(chǎn)物的可溶性分析。Westernbolt分析結(jié)果表明MAR成功在大腸桿菌中成功的與GST進(jìn)行了融合表達(dá),表達(dá)的GST—MAR占表達(dá)總蛋白的18.6%,其中可溶性部分占90%以上。
3.GST—Prepro—Acc—royalisn、GST—Acc—royalisin純化及Acc—royalisin蛋白的獲得
本實(shí)驗(yàn)利用G
5、enScript Corporation蛋白純化試劑盒,將獲得的GST—PPAR及GST—MAR的基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,分別在500mL的菌液中純化出0.0134g及and0.0206g蛋白。Westernbolt印跡表明,純化的三種蛋白GST—PPAR、GST—MAR和GST均對GST一抗產(chǎn)生了很強(qiáng)的特異性的反應(yīng),證明GST—PPAR、GST—MAR融合蛋白純化成功。同時,將純化后的GST—MAR用凝血酶酶切獲得了單體MAR。
6、 4.Acc—royalisin重組表達(dá)產(chǎn)物對革蘭氏陽性細(xì)菌的抑菌活性研究
用GST—PPAR,PPAR及MAR的純化產(chǎn)物分別對革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus,黃色微球菌Micrococcus luteus和枯草芽孢桿菌Bacillus subalis.進(jìn)行了抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明:三種純化產(chǎn)物對這三類革蘭氏陽性菌均有拮抗作用,且效果明顯,與屬于具有防腐功能的商品化食品添加劑—抗菌
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