牦牛中性粒細胞抗菌肽分離純化、LAP基因克隆及原核表達.pdf

1、內源性抗微生物肽是生物體內先天性免疫的重要組成成分，防御素(defensins)是廣泛分布于動物和植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子內源性抗微生物肽，是內源性抗微生物肽中的一個大家族。是由生物細胞特定基因編碼，經特定外界條件誘導產生的一類多肽，具有抵抗外界微生物侵害、消除體內突變細胞的作用。根據防御素分子內半胱氨酸的位置和連接方式、前體性質及表達位置的差異可分為α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆蟲防御素和植物防御素五種類型。β-防御素

2、主要分布于哺乳動物的黏膜上皮細胞內，所以，β-防御素被確認為黏膜表面抗微生物屏障的組成成分。 本試驗以牦牛為實驗材料，無菌采血，用40％聚蔗糖和76％復方泛影葡胺按一定比例配制成細胞分層液，以確定牦牛中性粒細胞及其他主要血細胞的漂浮密度。然后配制Percoll分層液通過密度梯度離心法分離純化牦牛中性粒細胞，用5％的冰乙酸抽提結合高速離心獲得中性粒細胞粗提物，并進行了體外抑菌活性、溶血和對血細胞凝集的活性測定?；钚詸z測結果表明，

3、牦牛中性粒細胞粗提物對三種測試菌有很強的抑菌活性，對兔和綿羊紅細胞沒有發(fā)生溶血現象，對兔血細胞稍有凝集(+)而對綿羊紅細胞無凝集。對牦牛中性粒細胞粗提物進行了分離純化。通過Bio-Gel P-10凝膠過濾和反相高效液相色譜(RP-HPLC)，收集到牦牛中性粒細胞提取物樣品共22個峰，其中檢測出9個抑菌活性峰。選取有抑菌活性的9個峰進行了質譜分析。 在試驗中我們以牦牛為材料，從牦牛舌黏膜上皮組織中提取總RNA，根據反芻動物-牛β

4、-防御素eDNA的保守序列設計了一對引物，采用RT-PCR技術擴增出yLAP的eDNA，并重組到pGM-T載體，經限制性內切酶圖譜分析后進行DNA序列測定，測序結果證實所克隆的yLAP的cDNA為β-防御素，因為該eDNA包含一個由192個堿基組成的開放讀碼框(Open Reading Frame，ORF)，該ORF編碼64個氨基酸殘基的前原防御素肽，該前原防御素肽含有β-防御素的特征性結構，即6個在特定位置上的保守半胱氨酸殘基。通過計

5、算機軟件分析其堿基分布、核苷酸和氨基酸同源性等。結果表明，yLAP基因與GenBank中已報道序列的同源性為99％：將yLAP和其他哺乳動物β-防御素進行aDNA堿基序列和前原肽氨基酸序列的同源性比較分析，結果顯示：yLAP與馴鹿、山羊和水牛的β-防御素序列一致性最高(91.7％，88.5％，93.1％)，與豬、驢和馬的β-防御素之間的次之(64.5％～73.3％)，與犬和恒河猴的β-防御素的最低(在30％以下)。由此可以看出yLAP的

6、cDNA序列與馴鹿、山羊和水牛的β-防御素親緣關系較近，這說明防御素進化的多樣性。再以重組質粒為模板，用特異性表達引物擴增得到目的基因：即編碼yLAP的CDS片段(207bp)，將其定向克隆到pET-28a(+)表達載體中，構建的原核表達質粒pET-yLAP轉化大腸桿菌BL21(DE3)，結果表明，成功表達出17KDa左右的目的蛋白。經優(yōu)化實驗，確定最佳誘導表達條件為終濃1mmol/L的IPTG在37℃，pH值7.2條件下誘導表達6h。