鱷龜抗菌肽的分離純化和抗菌效果研究.pdf

1、抗菌肽是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的新一代抗菌劑，對(duì)生物體免疫有重要作用。但爬行動(dòng)物的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本文初步研究鱷龜腸道、血液、肝臟和皮膚組織粗提物的抗菌活性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了鱷龜血液抗菌肽的分離純化過程及其相關(guān)性質(zhì)。研究包括四個(gè)試驗(yàn)。 試驗(yàn)一、鱷龜不同部位抗菌物質(zhì)的初提 本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨提取法和改進(jìn)的乙酸提取法兩種不同的方法從誘導(dǎo)后的稚鱷龜腸道、血液、肝和皮膚組織內(nèi)分離抗菌肽，研究鱷龜體內(nèi)產(chǎn)生抗菌肽的能力及抗菌效果。其

2、中乙酸浸提法成功分離出具有抗菌活性的抗菌肽粗提物。用嗜水氣單胞菌和沙門氏菌為指示菌，結(jié)果顯示血液和腸提取物的抗菌效果明顯，腸提取物的抗菌圈大于血液提取物的抗菌圈，但肝和皮膚組織的提取物未觀察到抗菌圈。由此可見，抗菌物質(zhì)在血液和腸組織中含量較多，在皮膚和肝臟中抗菌成分的含量比較少。 試驗(yàn)二、誘導(dǎo)劑量對(duì)幼鱷龜血液抗菌活性物的影響 將鱷龜隨機(jī)分成四組，每組4只。第一組，注射0.5ml生理鹽水；第二、三、四組分別腹腔注射滅活致病

3、性嗜水氣單胞菌1×109個(gè)/ml菌液0.1ml/只，0.3ml/只，0.5ml/只；各組分別在誘導(dǎo)后12h尾靜脈采血。本研究采用改進(jìn)的Tris-HCl緩沖液提取鱷魚龜血液抗菌肽類物質(zhì)，第一組、第二組、第三組和第四組的粗制品對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、嗜水氣單胞菌的殺菌率分別為41.7％，56.7％，63.0％和68.8％；53.3％，61.5％，78.0％和88.9％；56.1，67.5％，83.9％和98.1％。但鱷龜血液粗制品對(duì)3株菌的抑

4、菌圈不明顯。由此可見，誘導(dǎo)組比對(duì)照組效果好，且殺菌效果隨誘導(dǎo)劑量的增加而提高。抗菌肽粗制品經(jīng)過PAGE電泳后，可見高劑量組電泳條帶顏色明顯比低劑量組深，說明高劑量誘導(dǎo)組的蛋白質(zhì)含量比底劑量組高。 試驗(yàn)三、鱷龜血液抗菌肽的分離純化 本研究采用SephadexG-50凝膠柱過濾層析鱷龜血液抗菌肽，層析柱規(guī)格為2.6×100cm，洗脫液為0.5％的甲醇，流速為0.5ml/min，1管/10min。分離純化效果比較理想，峰之間區(qū)

5、分得非常明顯，其活性峰為Ⅳ峰的26-30管，其中第28管的抗菌活性最強(qiáng)。聚丙烯酞胺凝膠電泳和SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳結(jié)果表明，電泳圖譜均為單一條帶，說明分離的鱷龜血液抗菌肽已經(jīng)達(dá)到電泳純，其分子量約為6000Da-8000Da。 試驗(yàn)四、鱷龜血液抗菌肽抗菌譜的測(cè)定及性質(zhì)研究 研究顯示，分離純化的血液抗菌肽對(duì)G-細(xì)菌和G+細(xì)菌均有不同程度的抑制或殺滅作用，但不同的微生物對(duì)其敏感性不同。其對(duì)致病性嗜水氣單胞菌、葡萄球菌、枯