禽類白細(xì)胞抗菌肽的提取分離與抗菌活性的比較.pdf

1、本試驗(yàn)以櫻桃谷鴨、羅曼蛋雞、三黃肉雞、羅斯308肉雞為研究對(duì)象，對(duì)其血液白細(xì)胞抗菌肽成分進(jìn)行了提取和分離，并對(duì)體外抗菌活性進(jìn)行了比較。而從鴨白細(xì)胞分離出抗菌活性肽的工作在國內(nèi)尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)共分兩個(gè)系列。 系列Ⅰ禽類白細(xì)胞抗菌肽的提取分離 抗菌肽粗提物的提取收集禽類新鮮抗凝血，應(yīng)用0.83％氯化銨溶液裂解至染色鏡檢無紅細(xì)胞，低溫離心，收集白細(xì)胞沉淀。將白細(xì)胞沉淀超聲波破碎至染色鏡檢無完整細(xì)胞，低溫高速離心提取細(xì)胞顆粒。

2、10％醋酸溶液4℃下攪拌萃取抗菌肽，低溫高速離心收集上清液，真空冷凍干燥，用0.01％醋酸溶液溶解即為抗菌肽粗提物。體外抗菌試驗(yàn)表明，該抗菌肽粗提物對(duì)G+細(xì)菌和G-細(xì)菌及真菌均有抗菌作用。 抗菌肽粗提物分離、提純應(yīng)用離子交換層析法將抗菌肽粗提物初步分離成兩部分即陰離子組分和陽離子組分。將陽離子組分用HPLC法進(jìn)行二步分離獲得有抗菌活性的目的蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)HPLC分離得到多個(gè)抗菌活性產(chǎn)物，且抗菌活性產(chǎn)物均分布在14～50％乙腈

3、梯度范圍內(nèi)。 分子量測定應(yīng)用SDS-PAGE凝膠電泳方法檢測目的蛋白的純度，并初步測定其分子量，結(jié)果表明，抗菌活性產(chǎn)物分子量在3，313～5，856Da之間。進(jìn)一步用質(zhì)譜儀測定其分子量，結(jié)果表明，抗菌活性產(chǎn)物分子量在3，800～4，300Da之間。 系列Ⅱ禽類白細(xì)胞抗菌肽的抗菌活性的比較 離子交換層析陽離子組分的抗菌活性的比較應(yīng)用微量瓊脂糖彌散法測定離子交換層析產(chǎn)物的抗菌活性后，采用96孔微量反應(yīng)板法測定最低抑菌

4、濃度(MIC)。結(jié)果表明，抗菌肽粗提物離子交換層析陰離子組分無抗菌活性；陽離子組分對(duì)G+細(xì)菌和G-細(xì)菌及真菌均有抗菌作用。最低抑菌濃度由低到高依次為櫻桃谷鴨、羅曼蛋雞、三黃肉雞、羅斯308肉雞。SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，櫻桃谷鴨、羅曼蛋雞、三黃肉雞對(duì)大腸桿菌O78、腸炎沙門氏菌50041、霍亂沙門氏菌50019、傷寒桿菌686、金黃色葡萄球菌1056MRSA、豬鏈球菌和白色念珠菌ATCC10231的抗菌活性與羅斯308肉雞相比，差異顯

5、著。這說明禽類白細(xì)胞抗菌肽的數(shù)量和質(zhì)量可能存在種間和品種間的差異，從而使其在生產(chǎn)實(shí)踐中所表現(xiàn)出的抗病力和適應(yīng)性不同。 抗菌肽HPLC分離產(chǎn)物的抗菌活性比較選擇經(jīng)抗菌肽HPLC分離的抗菌活性好的產(chǎn)物進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)測定，結(jié)果表明，最低抑菌濃度由低到高的順序與其陽離子組分的一致，與其在生產(chǎn)實(shí)踐中所表現(xiàn)出的抗病力和適應(yīng)性相符。SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，對(duì)大腸桿菌O78、腸炎沙門氏菌50041的MIC進(jìn)行比較，櫻桃谷鴨與三黃