黃鱔腸道cDNA文庫構(gòu)建、EST分析及抗菌肽基因的原核表達(dá).pdf

1、黃鱔(Monopterus albus)是廣泛分布于我國南北水域的名優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。本文運(yùn)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、基因工程等技術(shù)與方法，通過構(gòu)建腸道cDNA文庫對黃鱔腸道內(nèi)營養(yǎng)代謝、免疫相關(guān)功能基因進(jìn)行了一些初步分析與探討；并對黃鱔抗菌肽hepcidin的原核表達(dá)進(jìn)行了初步研究。
　　 首次成功構(gòu)建了黃鱔全腸未剪切cDNA文庫。經(jīng)檢測，文庫的庫容量達(dá)到1.46×107cfu，重組陽性克隆率為96.88％，平均插入片段約2.

2、11kb，符合高質(zhì)量文庫要求。隨機(jī)從文庫中挑取1056個(gè)陽性克隆進(jìn)行5’單向測序，去除載體序列與低質(zhì)量序列后獲得了906條高質(zhì)量的EST序列，平均長度為812bp，并提交到dbEST數(shù)據(jù)庫(GenBankaccessionnumber:GW584265-GW585168)。通過拼接與組裝，共獲得762條有效的一致序列，其中61個(gè)重疊群包含2條以上的EST，其余701個(gè)僅含有一條EST。運(yùn)用NCBIBLAST對序列進(jìn)行比對，SeqGO進(jìn)行

3、功能注釋。鑒定出與營養(yǎng)相關(guān)的EST共有5類，59種：蛋白質(zhì)氨基酸代謝類25種，碳水化合物代謝類13種，脂類代謝類5種，能量代謝類12種，無機(jī)離子代謝類4種；發(fā)現(xiàn)免疫相關(guān)基因共73個(gè)，首次證實(shí)了腸道內(nèi)存在大量與黃鱔免疫功能相關(guān)的基因，其中包括幾丁質(zhì)酶、溶菌酶、凝集素、抗氧化酶類、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、熱休克蛋白(HSP)、IgM等；在黃鱔腸道中還發(fā)現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子(ECC)，這是該基因首次在硬骨魚類中得到證實(shí)。
　

4、　 應(yīng)用PCR技術(shù)從文庫中篩選出了黃鱔抗菌肽基因hepcidin(GenBank accessionnumber:GU997139)，應(yīng)用在線分析軟件，對篩選的抗菌肽基因hepcidin進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)其ORF區(qū)域?yàn)?73bp，編碼90個(gè)氨基酸殘基的陽離子抗菌肽，分子量為10236Da。進(jìn)一步分析抗菌肽蛋白質(zhì)序列，包含24個(gè)氨基酸的信號肽和40個(gè)氨基酸的前域部分，成熟肽為26肽，結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其屬于β-折疊類抗菌肽，包含有hepci

5、din類抗菌肽典型的8個(gè)半胱氨酸結(jié)構(gòu)，形成4對二硫鍵。同源比對發(fā)現(xiàn)黃鱔hepcidin與多種動物的hepcidin序列高度同源，與大黃魚和黑鱸hepcidin的相似性高達(dá)81％。
　　 利用基因工程技術(shù)，首次對黃鱔hepcidin基因在原核細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行了初步研究。分別構(gòu)建了pET22b(+)重組表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)黃鱔抗菌肽hepcidin基因構(gòu)建的pET22b(+)表達(dá)載體在原核細(xì)胞中不能表達(dá)。通過pET43.1a(+)構(gòu)建黃鱔h

6、epcidin基因融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS，BL21Star(DE3)pLysS和BL21-CondonPlus(DE3)-RIPL三種表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組pET43.1a(+)-hepcidin在原核細(xì)胞中均無明顯表達(dá)。在pET32a(+)載體中分別構(gòu)建黃鱔hepcidin全長編碼序列(pET32a(+)-hepcidin)和去信號肽序列(pET32a(+)-nhepcidin）重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到BL

7、21(DE3)pLysS，BL21Star(DE3)pLysS，BL21-CondonPlus(DE3)-RIPL三種不同的表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)含有信號肽的pET32a(+)-hepcidin重組表達(dá)載體在三種菌株中均不能正常表達(dá)；而不含信號肽的pET32a(+)-nhepcidin重組表達(dá)載體在BL21-CondonPlus(DE3)-RIPL中能高效表達(dá)。通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，獲得黃鱔抗菌肽pET32a(+)-nhepcid

8、in重組載體在BL21-CondonPlus(DE3)-RIPL中的最佳表達(dá)條件為菌液濃度(OD600)0.5-0.7、溫度為37℃、IPTG濃度0.5mM、誘導(dǎo)時(shí)間4-6h；鑒定發(fā)現(xiàn)pET32a(+)-nhepcidin在BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL表達(dá)菌株中為可溶表達(dá)重組蛋白。
　　 本試驗(yàn)首次成功構(gòu)建了黃鱔腸道未剪切cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了許多與腸道營養(yǎng)代謝和抗病相關(guān)的EST序列，為黃鱔腸道功能基因的研究奠