融合蛋白Append的原核表達(dá)及活性測(cè)定.pdf

1、細(xì)胞的無(wú)限制增長(zhǎng)和腫瘤血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵因素，如果抗腫瘤藥物能夠同時(shí)瞄準(zhǔn)一個(gè)以上的目標(biāo)，采取“多個(gè)靶點(diǎn)”方式攻擊癌細(xì)胞，就可能獲得更好的臨床效果。 凋亡素(apoptin)是一種來(lái)源于雞貧血病病毒(chicken anemia virus,CAV)的小蛋白質(zhì)(VP3)，由121個(gè)氨基酸組成，分子量為13.6kDa，它能夠特異性地誘導(dǎo)人轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的凋亡。一系列的研究結(jié)果已證實(shí)apoptin作為一種抗腫瘤制

2、劑是安全有效的。 血管內(nèi)皮抑素(endostatin)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的最有效血管生成抑制因子之一。Endostatin為膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，編碼184個(gè)氨基酸，分子量為20kDa。 在本研究中，構(gòu)建了一種新的融合基因，命名為Append，其表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)為以柔性多肽-甘氨酸接頭(Gly<,4>Ser)<,3>將apoptin與endostatin連接起來(lái)的融合蛋白；之后利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該融合蛋白并對(duì)其生物功能進(jìn)行

3、評(píng)價(jià)。 本研究針對(duì)內(nèi)皮抑素cDNA序列設(shè)計(jì)引物，用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從人胎肝總RNA中釣取內(nèi)皮抑素cDNA；根據(jù)apoptin基因序列設(shè)計(jì)引物，用聚合酶鏈反應(yīng)從質(zhì)粒pUC-Apoptin中擴(kuò)增凋亡素基因；采用重疊引物延伸法，使凋亡素基因和內(nèi)皮抑素基因通過(guò)一個(gè)(Oly<,4>Ser)<,3>的連接肽基因相連接，構(gòu)成融合基因Append；將融合基因Append克隆入pOEM-T easy載體中，通過(guò)酶切、PcR及序列測(cè)定；將測(cè)序正確

4、的Append融合基因分別克隆進(jìn)3種原核表達(dá)載體pLLP-OmpA、pET-His和pET-DsbA中，并將鑒定正確的原核表達(dá)載體分別命名為：pLLP-OmpA-Append、pET-His-Append和pET-DsbA-Append；之后優(yōu)化原核表達(dá)條件；采用鎳瓊脂糖親和層析法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化；純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE及Western Blot檢測(cè)，并進(jìn)行活性測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用重疊引物延伸法獲得了融合基因A

5、ppend，全長(zhǎng)為960bp，與預(yù)期相符；共構(gòu)建了3個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)優(yōu)化原核表達(dá)條件確定pLLP-OmpA-Append最適于表達(dá)Append融合蛋白，可溶性蛋白的表達(dá)量為1.43mg/L，純度為91.7％。純化的Append融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，獲得的目的蛋白大小與預(yù)期相符，約為33.6kDa，Western blot鑒定結(jié)果為陽(yáng)性；活性測(cè)定結(jié)果表明Append融合蛋白在體外可以抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并可誘導(dǎo)人神經(jīng)膠