北柴胡3個(gè)UGT基因表達(dá)特性及其原核表達(dá)與蛋白純化.pdf

1、目的：
　　分析北柴胡3個(gè)UGT基因的MeJA誘導(dǎo)表達(dá)特性和組織表達(dá)，原核表達(dá)并純化出UGT蛋白，為進(jìn)行體外催化反應(yīng)分析UGT基因功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　提取MeJA處理不定根和未處理對(duì)照不定根的RNA以及北柴胡根、莖、葉、花和果實(shí)中的RNA，以柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶β-AS基因?yàn)閰⒄?，qRT-PCR分析BcUGT1、BcUGT3和BcUGT6的MeJA誘導(dǎo)表達(dá)和組織表達(dá)變化。設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的PCR引物，PC

2、R擴(kuò)增BcUGT1、BcUGT3和BcUGT6的ORF，酶切后，分別插入到pET-28a（+）、pET-30a（+）載體中，以構(gòu)建出原核表達(dá)載體。利用大腸桿菌BL21（DE3）plysS、BL21-CodonPlus（DE3）和Rosetta-gamiB（DE3）plysS三種不同菌株不同溫度及IPTG濃度表達(dá)外源蛋白UGT。采用PrepEase His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化重組蛋白，Western blot證實(shí)蛋白誘導(dǎo)純化。
　

3、　結(jié)果：
　　利用qRT-PCR分析BcUGT1、BcUGT3和BcUGT6與柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶基因β-AS的共誘導(dǎo)表達(dá)和組織表達(dá)，以β-AS的模式為參照，β-AS主要在根中表達(dá)。
　　共誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，MeJA處理后，柴胡皂苷a含量增加與BcUGT1基因表達(dá)量增加相對(duì)應(yīng)。BcUGT3和BcUGT6表達(dá)水平均有所提高，BcUGT3的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加，4 d時(shí)，達(dá)7倍左右，BcUGT6表達(dá)水平均提高2倍左右。

4、>　　組織表達(dá)結(jié)果顯示，BcUGT1在根中的表達(dá)相對(duì)較高，其次是在果實(shí)和莖中的表達(dá)，在葉和花中的表達(dá)量較低。BcUGT3在根、葉、花和果中的表達(dá)水平相當(dāng)，均高于莖中的表達(dá)水平。BcUGT6在葉中表達(dá)水平最高，在花中表達(dá)水平最低。
　　原核表達(dá)結(jié)果顯示，BcUGT1以pET-28a（+）和pET-30a（+）為載體，BcUGT3以pET-28a（+）為載體，均以BL21-CodonPlus（DE3）-RIPL為宿主菌，0.5 mM或

5、1 mM IPTG，16℃，20 h為條件，誘導(dǎo)出了目的蛋白。BcUGT6以pET-28a（+）為載體，Rosetta-gami B（DE3）plysS為宿主菌，0.5 mM IPTG，20℃，24 h為條件，誘導(dǎo)出了目的蛋白。均利用PrepEase His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，純化獲得了目的蛋白。
　　結(jié)論：
　　BcUGT1、BcUGT3和BcUGT6基因的表達(dá)特性分析表明這三個(gè)基因可能參與柴胡皂苷生物合成，三個(gè)基因的體外