抗Fas錘頭狀核酶增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞殺傷粒-單核白血病細(xì)胞作用的研究.pdf

1、移植后復(fù)發(fā)仍是對(duì)許多血液病人施行異基因骨髓移植的主要障礙之一。近年來(lái)的臨床移植實(shí)踐證實(shí)供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療在誘導(dǎo)GVL作用，鞏固供者型嵌合體，治療異體造血干細(xì)胞移植(Allo-HSCT)后復(fù)發(fā)，以及移植后病毒感染等方面取得了可喜效果。更有研究表明，Allo-HSCT根治白血病不僅是移植前預(yù)處理的結(jié)果，移植后供者淋巴細(xì)胞的GVL起著根本性功效。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)供者T淋巴細(xì)胞(包括CD4+和CD8+細(xì)胞)在DLI后誘導(dǎo)

2、的GVL效用中起重要作用，CD4+T細(xì)胞在抗原提呈細(xì)胞(APC)的參與下，識(shí)別白血病細(xì)胞編碼的抗原而被活化，進(jìn)而激活CD8+T細(xì)胞使之成為效應(yīng)性CTL，CTL可識(shí)別白血病細(xì)胞表面的MHC-Ⅰ類分子-白血病抗原肽復(fù)合物，被激活而發(fā)揮GVL作用?；罨腡細(xì)胞表面Fas及FasL表達(dá)均增高，而大量研究表明在體內(nèi)異常微環(huán)境及一系列細(xì)胞因子的作用下，白血病細(xì)胞表面可高表達(dá)FasL，并可通過(guò)Fas-FasL途徑誘導(dǎo)Fas+的T細(xì)胞凋亡，降低其GVL

3、效應(yīng)，從而逃逸免疫應(yīng)答，即所謂白血病細(xì)胞的“Fas反擊”作用。從提高DLI誘導(dǎo)的GVL效應(yīng)的角度出發(fā)，本課題構(gòu)建了針對(duì)小鼠Fas的錘頭狀核酶，將其導(dǎo)入小鼠T細(xì)胞，觀察該核酶對(duì)T細(xì)胞凋亡、增殖以及T細(xì)胞對(duì)粒單核白血病細(xì)胞株(WEHI-3)殺傷作用的影響，探索供者淋巴細(xì)胞輸注時(shí)提高GVL作用的新途徑。 第一部分切割小鼠FASmRNA錘頭狀核酶的構(gòu)建及其體內(nèi)外切割活性的鑒定 [目的]設(shè)計(jì)合成了針對(duì)小鼠FASmRNA的錘頭狀核酶

4、基因，構(gòu)建其細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄載體和真核表達(dá)載體，使其在U6RNA聚合酶Ⅲ的作用下于細(xì)胞內(nèi)高效轉(zhuǎn)錄。并篩選出細(xì)胞外切割活性最佳的核酶，以高表達(dá)FAS的小鼠淋巴瘤細(xì)胞株Yac-1作為模型，研究核酶修飾的FAS基因?qū)υ摷?xì)胞Fas表達(dá)及增殖的影響，探索更為有效的抗凋亡的新途徑，并為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。 [方法]設(shè)計(jì)并合成針對(duì)小鼠FASmRNA93，140和596位點(diǎn)的錘頭狀核酶，同時(shí)合成針對(duì)596位點(diǎn)的突變型核酶(G3→A3)作為對(duì)照，以排除

5、反義序列互補(bǔ)作用。應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建核酶的細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄和真核表達(dá)載體，使核酶在U6RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子作用下高效轉(zhuǎn)錄。胞外轉(zhuǎn)錄出核酶和靶基因，進(jìn)行細(xì)胞外切割反應(yīng)檢測(cè)四種核酶對(duì)FAS的切割作用，篩選出切割效率最佳的核酶。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染法將篩選出的核酶穩(wěn)定導(dǎo)入Yac-1細(xì)胞，RT-PCR測(cè)細(xì)胞內(nèi)核酶的表達(dá)，通過(guò)RT-PCR、免疫組化檢測(cè)細(xì)胞上FAS的表達(dá)，細(xì)胞經(jīng)抗小鼠FAS的抗體(JO2)作用后，通過(guò)MTT法觀察細(xì)胞的增殖情況。 [

6、結(jié)果]測(cè)序證實(shí)核酶基因被正確克隆入細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄載體pBSKU6和真核載體pEGFPPC1中。僅RZ596在細(xì)胞外具有切割靶基因的活性，切割效率達(dá)60％，RZ93、RZ140與突變型核酶無(wú)明顯切割作用。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染法將RZ596成功導(dǎo)入高表達(dá)FAS的Yac-1細(xì)胞，RT-PCR證實(shí)嵌于U6啟動(dòng)子中的核酶在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。RT-PCR和免疫組化結(jié)果提示FAS在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯下降，細(xì)胞經(jīng)抗小鼠的JO2抗體作用后，轉(zhuǎn)染核酶的細(xì)胞增

7、殖活性較對(duì)照組明顯增高，與之相反，轉(zhuǎn)染突變型核酶dRZ596的細(xì)胞無(wú)此結(jié)果。 [結(jié)論]本課題構(gòu)建的U6嵌合型錘頭狀核酶RZ596在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外均具能有效切割FAS，且轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后能高效表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)Fas基因和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖活性，為研究抑制T細(xì)胞的凋亡從而增強(qiáng)其對(duì)WEHI-3的殺傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二部分錘頭狀核酶增強(qiáng)小鼠T細(xì)胞殺傷粒-單核白血病細(xì)胞作用的研究 [目的]研究針對(duì)FASmRNA59

8、6位點(diǎn)的錘頭狀核酶對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠脾臟T細(xì)胞和CTL細(xì)胞系CTLL-2上FAS表達(dá)及其介導(dǎo)的凋亡的抑制作用，探索增強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)粒單核白血病細(xì)胞株(WEHI-3)殺傷作用，提高供者淋巴輸注(DLI)時(shí)T細(xì)胞GVL效應(yīng)的新途徑。 [方法]通過(guò)尼龍棉柱法分離小鼠脾臟T細(xì)胞，與CTLL-2在IL-2條件下常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)得其CD3和FAS的表達(dá)。通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染法將pEGFP-RZ596與pEGFPC1導(dǎo)入T細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR和

9、Westernblot分別檢測(cè)T細(xì)胞上FasmRNA和蛋白水平的表達(dá)；細(xì)胞與高表達(dá)FasL的小鼠急性粒-單核細(xì)胞白血病細(xì)胞株(WEHI-3)混合培養(yǎng)后，通過(guò)caspase-3活性檢測(cè)試劑盒測(cè)各組細(xì)胞caspase-3活性的變化，MTT法測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況，Annexin-V凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)細(xì)胞凋亡，以乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗(yàn)檢測(cè)CTL的體外殺傷活性。 [結(jié)果]尼龍棉柱法成功分離了小鼠脾臟T細(xì)胞(CD3陽(yáng)性率大于90％)，經(jīng)

10、IL-2活化后高表達(dá)Fas。電穿孔轉(zhuǎn)染法能將核酶成功地導(dǎo)入小鼠T細(xì)胞，與對(duì)照組、空載體轉(zhuǎn)染組相比，細(xì)胞表面的Fas表達(dá)明顯降低；與WEHI-3孵育后，與空白對(duì)照、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染核酶的細(xì)胞增殖活性明顯增加，而細(xì)胞的caspase-3活性降低，且細(xì)胞的凋亡率顯著降低，且T細(xì)胞的體外殺傷活性亦顯著增強(qiáng)。 [結(jié)論]小鼠活化T細(xì)胞和細(xì)胞因子處理的CTLL-2上表達(dá)Fas，抗Fas核酶能顯著降低其Fas水平，使細(xì)胞免于Fas途徑