白細(xì)胞介素21增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗白血病作用的研究.pdf

1、目的:
　　 研究白細(xì)胞介素21(IL-21)對(duì)外周血來(lái)源CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞）抗白血病的作用及其作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、采集分離正常人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，加用細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞。
　　 2、構(gòu)建表達(dá)IL-21基因的慢病毒載體，感染CIK細(xì)胞并鑒定。
　　 3、MTT法檢測(cè)外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細(xì)胞的增殖能力及殺傷白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞作用。
　　

2、 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細(xì)胞免疫表型及其表面IL-21受體(IL-21R)、FasL、細(xì)胞內(nèi)穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)。
　　 5、半定量RT-PCR法檢測(cè)外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、TNF-β、穿孔素、顆粒酶A、顆粒酶B、FasL和NKG2D mRNA的表達(dá)。
　　 6、酶聯(lián)免疫法檢測(cè)外源及內(nèi)源IL-21作用下CIK細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的表達(dá)。<

3、br>　　 7、Western blot法檢測(cè)外源IL-21作用下CIK細(xì)胞JAK-STAT信號(hào)途徑的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、在外源IL-21作用下:
　　 (1)總的細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增無(wú)明顯變化，CIK細(xì)胞的產(chǎn)生由（17.5±4.7）％升至(26.5±2.1)％(p＜0.05)。
　　 (2) CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用由(22.8±2.8)％升至(44.6±8.3)％。(p＜0.05)<

4、br>　　 (3) CIK細(xì)胞表面IL-21R的表達(dá)增加約2倍。
　　 (4) CIK細(xì)胞IFN-γ mRNA的表達(dá)升高了經(jīng)2倍由0.3760±0.2358升至0.7786±0.2493(p＜0.05)，TNF-α mRNA的表達(dá)升高約2倍由0.6557±0.1598升至1.3145±0.2136(p＜0.05)，穿孔素mRNA的表達(dá)升高了約1.5倍由0.6361±0.1457升至0.9831±0.1265(p＜0.05)，顆

5、粒酶B mRNA的表達(dá)量升高了近2倍由0.4084±0.1589升至0.7319±0.1639(p＜0.05)，F(xiàn)asLmRNA的表達(dá)升高了約2倍由0.4015±0.2842升至0.7381±0.2568(p＜0.05)，顆粒酶A、TNF-β和NKG2D mRNA的表達(dá)與對(duì)照相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (5)對(duì)mRNA表達(dá)有差異的指標(biāo)進(jìn)一步行蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):CIK細(xì)胞表面FasL的表達(dá)水平加IL-21組(0.19％)與未加

6、IL-21組(0.04％)有明顯差異，CIK細(xì)胞內(nèi)穿孔素的表達(dá)由35.28％升至53.16％，顆粒酶B的表達(dá)由43.16％升至78.82％，培養(yǎng)上清中IFN-γ的表達(dá)由(25.8±6.1) ng/L升至(56.0±2.3)ng/L(p＜0.05)，TNF-α的表達(dá)由(5.64±0.61)μg/L升至(15.14±0.93)μg/L(p＜0.05)。
　　 (6) Western blot結(jié)果顯示STAT1和STAT5a的表達(dá)無(wú)明

7、顯差異，STAT3和STAT5b的表達(dá)增加。
　　 2、在內(nèi)源IL-21作用下:經(jīng)酶切與測(cè)序鑒定，IL-21慢病毒載體構(gòu)建正確，共轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞中有目的基因IL-21的表達(dá)。與對(duì)照相比:
　　 (1)總的細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增無(wú)明顯變化，CIK細(xì)胞的產(chǎn)生由（16.95±4.7）％升至(24.60±2.1)％(p＜0.05)。
　　 (2) CIK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用由（23.28±2.8）％升至（58.42±8.

8、3）％(p＜0.05)，作用5天后仍能維持在（61.16±6.2）％(p＜0.05)，相比外源作用由（22.80±2.8）％升至（44.60±8.3）％(p＜0.05)，殺傷作用更強(qiáng)，而且作用時(shí)間更長(zhǎng)久。
　　 (3) CIK細(xì)胞表面IL-21R的表達(dá)增加約2倍。
　　 (4) CIK細(xì)胞IFN-γ和TNF-αmRNA的表達(dá)升高了1.5倍多，穿孔素、顆粒酶B、FasL mRNA的表達(dá)量升高了近2倍，顆粒酶A、TNF-β和

9、NKG2D mRNA的表達(dá)與對(duì)照無(wú)明顯差別。
　　 (5)對(duì)mRNA表達(dá)有差異的指標(biāo)進(jìn)一步行蛋白表達(dá)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):CIK細(xì)胞表面FasL的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染IL-21組(0.56％)與對(duì)照組(0.06％)有明顯差異，CIK細(xì)胞內(nèi)穿孔素的表達(dá)由12.23％升至25.86％，顆粒酶B的表達(dá)由14.56％升至37.58％，IFN-γ的表達(dá)由（23.2±5.6）ng/L升至（55.3±3.5）ng/L(p＜0.05)，TNF-α的表達(dá)由（5.6

10、5±0.58）μg/L升至（15.62±0.62）μg/L(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 IL-21具有增強(qiáng)CIK細(xì)胞抗白血病的作用，IL-21與IL-2具有協(xié)同作用，而且內(nèi)源作用下作用時(shí)間更長(zhǎng)久，此作用是通過(guò)增加其受體的表達(dá)，增加穿孔素、顆粒酶B、FasL、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。JAK-STAT細(xì)胞信號(hào)途徑的激活是此種作用的機(jī)制之一。提示IL-21在增強(qiáng)白血病免疫治療中具有潛在的臨床應(yīng)用前景。<