抑制VEGF表達(dá)的錘頭狀核酶系統(tǒng)的建立與評估.pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤血管新生過程中的重要因子，是抗血管新生的腫瘤基因治療的重要靶點，本論文旨在建立和評估抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的錘頭狀核酶(hammerheadribozyme)技術(shù)系統(tǒng)，探討該系統(tǒng)在抗血管新生的腫瘤基因治療中可能的應(yīng)用。 為了建立和評估抑制血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的錘頭狀核酶技術(shù)系統(tǒng)，我們運用了如下技術(shù)手段：1，對VEGFl21基因mRNA序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，選擇靶點；2，設(shè)計并構(gòu)建針對VEGF的

2、分泌肽mRNA的可表達(dá)錘頭狀核酶(1—4)載體系統(tǒng)和VEGF一熒光色素酶融合基因報告質(zhì)粒；3，通過試管內(nèi)切割實驗等方法評估核酶對于試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到的VEGFRNA切割有效性和效率；4，通過瞬時共轉(zhuǎn)染實驗和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實驗評估核酶在細(xì)胞內(nèi)對于VEGFmRNA的切割效率；5，通過構(gòu)建缺陷型腺病毒導(dǎo)入系統(tǒng)評估核酶在細(xì)胞內(nèi)對于mRNA的切割效果；6，通過穩(wěn)定表達(dá)核酶的細(xì)胞株的裸鼠成瘤實驗評估抑制VEGF對于腫瘤形成和生長的作用。 研究結(jié)果顯示

3、：1，設(shè)計和構(gòu)建了對VEGFl2lmRNA二級結(jié)構(gòu)水平上的暴露區(qū)(+8，+36，和+71位點：核酶1，3和4)和非暴露區(qū)(+17：核酶2)四個錘頭狀核酶(1～4)質(zhì)粒；2，試管內(nèi)切割檢測表明，針對+8，+36，和+71位點的核酶(1，3和4)可以有效地在試管內(nèi)對VEGF121RNA進行特異性切割，使其水平分別降至對照的61．7％，27．6％和44．8％(熒光色素酶活性)或66．3％,27．0％和30．0％(蛋白質(zhì)水平)；3，將核酶表達(dá)質(zhì)

4、粒與VEGF-LUC模板質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染入SMMC一7721肝癌細(xì)胞，核酶1，3和4VEGF—LUC水平分別降低到對照的81．4％，56．6％和69．1％；4，穩(wěn)定表達(dá)針對VEGF的核酶1，3或4的SMMC一7721細(xì)胞株中，內(nèi)源性VEGFRNA的水平降至對照水平的5％；5，構(gòu)建了復(fù)制缺陷型腺病毒核酶導(dǎo)入系統(tǒng)；6，穩(wěn)定表達(dá)核酶的細(xì)胞株裸鼠成瘤實驗顯示，核酶3號可以抑制腫瘤的生長。 綜上，我們構(gòu)建的分別針對VEGFl2l+8，+36