腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)運的HDV核酶抑制HBV基因表達的初步研究.pdf

1、本課題組一直致力于研究反式作用HDV核酶對于乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）表達的工作，研究證實了HDV核酶作為HBV反義抑制劑的可行性，目前所需解決的是如何構(gòu)建高效、安全、且具有靶向性的轉(zhuǎn)移載體攜帶反式HDV核酶進入肝細胞內(nèi)發(fā)揮作用，更接近于臨床治療途徑。攜帶外源性治療基因的轉(zhuǎn)運載體是基因治療的一個中心環(huán)節(jié)，決定著外源性治療基因是否能夠成功轉(zhuǎn)運至靶細胞內(nèi)，也影響著外源性治療基因能否在細胞內(nèi)高效的表達。

2、 腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）屬于微小病毒科，依賴病毒屬。AAV是一種可感染人類和一些其他靈長類動物的的小病毒。目前AAV不導(dǎo)致任何已知的疾病，因此這種病毒只引起非常輕微的免疫反應(yīng)。AAV即可感染分裂期細胞也可感染非分裂期細胞，并可將其基因組整合入宿主細胞基因組中位于人19號染色體的特異位點（AAVS1）中。制備AAV基因治療載體是需要剔除AAV基因組中的rep和cap區(qū)域，并將所需外源基因和能夠啟

3、動其轉(zhuǎn)錄的啟動子插入到兩端的反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）之間，有助于單鏈DNA的載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞的DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA時在宿主細胞核內(nèi)形成多聯(lián)體結(jié)構(gòu)。腺相關(guān)病毒為基礎(chǔ)的基因治療載體在宿主細胞中主要以多聯(lián)體形式存在與宿主細胞核中。腺相關(guān)病毒還具有非常低的免疫原性，似乎僅限于新一代的中和抗體，但它們誘導(dǎo)沒有明確界定的細胞毒性反應(yīng)。這些特點使得AAV成為備受矚目的基因治療潛在病毒載體

4、。 HBV侵入肝細胞的機制是研究熱點之一。自發(fā)現(xiàn)HBV PreS2多肽與聚合白蛋白的結(jié)合活性只限于人和黑猩猩的聚合白蛋白而證實肝細胞存在白蛋白受體以來，便認為HBV系借這種白蛋白受體同肝臟結(jié)合即侵入肝細胞。這種由HBV被膜抗原蛋白HBV DNA preS2所編碼的聚合人血清白蛋白的受體（polymerized human serum albumin receptor，pHSA-R），又稱HBV聚合白蛋白受體（HBVpAR）很可

5、能具有HBV種特異性與臟器特異性，因而在HBV侵入肝細胞機制中起有基因的表達；探討重組腺相關(guān)病毒的靶向性改造以及重組后腺相關(guān)病毒的包裝制備方法。 研究方法: 重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建：利用DNA重組技術(shù)將本課題組前期設(shè)計合成的反式作用HDV片段及其啟動子U6一同構(gòu)建入腺相關(guān)病毒載體pSNAV中，并在此載體中摻入EGFP熒光標(biāo)記蛋白基因。 2、重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體抑制HBV基因表達：用陽離

6、子脂質(zhì)體法將帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的重組HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體轉(zhuǎn)染入表達HBV的肝癌細胞HepG2．2．15中，用Elisa方法檢測其S抗原和E抗原的表達抑制作用。 3、重組有HDV核酶的腺相關(guān)病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建：利用DNA重組技術(shù)將反式作用HDV片段及其啟動子U6一同構(gòu)建入腺相關(guān)病毒載體pAAV-IRES-hrGFP中。將肝細胞靶向性序列preS2構(gòu)建入表達AAV殼體蛋白的控制質(zhì)粒pAAV-RC中，并將AAV殼體蛋白中的感染

7、相關(guān)R585、R588位點通過突變的方式封閉。 4、重組腺相關(guān)病毒的包裝：將構(gòu)建好的帶有HDV核酶的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和靶向性改造后的控制質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T包裝細胞，反復(fù)凍融方法收獲重組腺相關(guān)病毒顆粒。然后感染肝癌細胞HepG2，檢測包裝效率。 研究結(jié)果： 1、經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建了分別含有針對HBV基因組C區(qū)和preS2區(qū)的反式作用HDV核酶的重組腺相關(guān)病毒載體pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和p

8、SNAV-CMV-EGFP-preS2-U6。 2、利用陽離子脂質(zhì)體法將pSNAV-CMV-EGFP-C-U6和pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染表達HBV的HepG2．2．15細胞，并用Elisa方法檢測到其對HBV表達的抑制作用。pSNAV-CMV-EGFP-preS2-U6對HBeAg和HBsAg的抑制率約為29．53％和25％，pSNAV-CMV-EGFP-C-U6對HBeAg和HBsAg的抑制效果約

9、為63．5％和50．07％， 3、經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，構(gòu)建了重組入反式作用HDV核酶的pAAV-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和重組入肝細胞靶向序列 preS2和AAV殼體蛋白靶向相關(guān)序列突變的控制質(zhì)粒pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588。 4、利用鈣磷沉淀法和陽離子脂質(zhì)體法將pAA

10、V-IRES-hrGFP-U6-CRZ和pAAV-IRES-hrGFP-U6-S2RZ結(jié)構(gòu)質(zhì)粒和pAAV-RC-preS2-cap-A、pAAV-RC-cap-preS2-B、pAAV-RC-A585-588控制質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒pHelper共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，收集包裝出的重組腺相關(guān)病毒顆粒。 5、經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，重組的腺相關(guān)病毒顆?？筛腥靖伟┘毎?，但其感染效率偏低。 結(jié)論： 本實驗構(gòu)建了重組HDV核酶的