大鼠生長相關(guān)蛋白基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆大鼠生長相關(guān)蛋白(ratgrowthassociatedprotein-43，rGAP-43)的基因片段，并以腺相關(guān)病毒(adeno-associatedviresvector，AAV)為載體構(gòu)建出rGAP-43的表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步研究rGAP-43對(duì)大鼠視網(wǎng)膜中各類細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ)，也為下一步進(jìn)行基因治療的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1．經(jīng)RT-PCR法，獲得SD大鼠腦組織的cDNA文庫，設(shè)計(jì)引物，

2、從中擴(kuò)增出GAP-43基因的開放讀碼框區(qū)(openreadingframe，ORF)基因片段，克隆入T載體，經(jīng)DNA序列測(cè)定正確后，再大量擴(kuò)增rGAP-43基因片段。 2．同時(shí)將報(bào)告基因一綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein，EGFP)經(jīng)SalI／BglII酶切后連接上經(jīng)同樣酶切AAV-MCS多克隆載體，重組命名為AAV-EGFP,進(jìn)行酶切鑒定與DNA序列測(cè)定。 3．將目的基因r

3、GAP-43經(jīng)BamHI／SalI酶切后連接上經(jīng)同樣酶切的含EGFP報(bào)告基因的AAV質(zhì)粒載體(AAV-EGFP)。重組表達(dá)質(zhì)粒命名為AAV-EGFP-rGAP-43，隨后針對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒AAV-EGFP-rGAP-43進(jìn)行酶切、DNA序列測(cè)定等結(jié)構(gòu)上的鑒定。 4．將重組表達(dá)質(zhì)粒及AAV轉(zhuǎn)染需要的輔助質(zhì)粒pilelper、pAAV-RC經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的AAV-293細(xì)胞，進(jìn)行熒光表達(dá)的檢測(cè)以及病毒的包裝、病毒原液的收集及病

4、毒感染性滴度的測(cè)定等。 結(jié)果：1．克隆出的rGAP-43基因的ORF區(qū)片段以及構(gòu)建的AAV-EGFP-rGAP-43重組表達(dá)質(zhì)粒，兩者經(jīng)DNA序列測(cè)定，所測(cè)序列與GeneBank檢索的完全一致。 2．重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的AAV-293細(xì)胞可檢測(cè)到報(bào)告基因綠色熒光的表達(dá)，根據(jù)表達(dá)熒光的細(xì)胞數(shù)得到重組病毒的感染性滴度為10。particles／mi。 結(jié)論：1．應(yīng)用分子生物學(xué)方法可以成功地克隆大鼠GAP-43基因并構(gòu)