中藥單體和載體自身優(yōu)化提高重組腺相關(guān)病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率.pdf

1、一、研究背景
　　重組腺相關(guān)病毒（rAAV）被認定為目前最有應(yīng)用前景的基因治療載體，并已經(jīng)被應(yīng)用多種疾病的基因治療的臨床試驗中。此外，世界上第一個以rAAV載體的基因治療藥物——Glybera也已經(jīng)于2012年底上市。
　　然而，rAAV介導(dǎo)的基因治療的療效距離徹底根治疾病還有一段距離，這主要是由于rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有限。rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不佳，必須使用大劑量的病毒載體。高劑量的rAAV載體導(dǎo)致基因治療費用的增加，還能誘導(dǎo)患者

2、機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，影響患者的健康，并可能降低后續(xù)基因治療的療效，因此，如何進一步優(yōu)化rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率一直是基因治療領(lǐng)域研究的熱門課題。
　　隨著對rAAV生命周期的不斷深刻認識，目前已經(jīng)有一系列提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法不斷被發(fā)現(xiàn)、證實和應(yīng)用，如篩選高效靶向的血清型或者rAAV變體，對rAAV或變體衣殼蛋白表面特定位點的氨基酸殘基進行定點突變，構(gòu)建雙鏈互補AAV（scAAV），在rAAV衣殼蛋白表面某些位點連接特異性的化學(xué)基團或

3、生物素、親和素，使用蛋白酶體抑制劑或糖皮質(zhì)激素類藥物等。
　　盡管如此，在rAAV從包裝、感染細胞到實現(xiàn)目的基因在靶細胞中穩(wěn)定表達的過程中，尚有一些環(huán)節(jié)被忽視，還有很多疑問沒有確切的答案。例如在包裝過程中，順式作用元件ITR與反式作用因子Rep對rAAV載體的包裝效率、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有影響嗎？現(xiàn)已知在rAAV感染細胞的過程，若固定細胞密度，提高感染復(fù)數(shù)(MOI)可以增加rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但是在固定MOI的情況下，增加細胞密度會使轉(zhuǎn)導(dǎo)效

4、率增加還是降低呢？
　　除此之外，中醫(yī)藥具有獨特的辨證論治體系，且中藥包含的藥物種類多、作用靶點廣，那么，可以借助于中醫(yī)理論的指導(dǎo)，通過藥物篩選，尋找到其他提高rAAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的方法嗎？
　　本研究主要針對以上這些疑問和思考，探究提高rAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的新方法，并對其在基因治療中的具體應(yīng)用展開研究，為這些方法在更大范圍內(nèi)的推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　二、研究方法
　?。ㄒ唬㏑ep3和ITR3在優(yōu)化rAAV

5、3包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率中的應(yīng)用
　　構(gòu)建含有相同Cap3基因但不同反式作用因子（Rep2或Rep3）的質(zhì)粒pAAVR2C3、pAAVR3C3，以及含有相同目的基因但不同順式作用因子(ITR2或ITR3)的質(zhì)粒 pITR2-CMVp-hrGFP、 pITR3-CMVp-hrGFP、pITR2-CMVp-EGFP-Neo、pITR3-CMVp-EGF-Neo，酶切鑒定及測序后開始實驗。
　　采用聚乙烯亞胺（PEI）法將等量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入H

6、EK293細胞，采用Western Blot法分析Rep、Cap蛋白表達差異;使用熒光顯微鏡分析目的基因的表達差異。使用三質(zhì)粒包裝法，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入HEK293細胞，qPCR方法分析目的基因復(fù)制效率的差異及包裝效率的區(qū)別。
　　使用Rep2ITR2、Rep3ITR3包裝出來的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo、ssAAV3-ITR3-CMVp-EGFP-Neo感染人肝癌細胞Huh7、LH86，使用熒光顯微鏡觀察并分

7、析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　?。ǘ┘毎芏葘AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響
　　通過固定感染體積，調(diào)整細胞數(shù)目，或固定細胞數(shù)目，調(diào)整感染體積來提高細胞密度，在K562細胞感染過程中按照不同的細胞密度，或感染過程中、感染過程后分別使用高低細胞密度，使用scAAV6-CBAp-EGFP或ssAAV6-CBAp-EGFP感染細胞，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，qPCR法分析病毒拷貝數(shù)。在K562高細胞密度的情況下，使用不同MOI的scAA

8、V6-CBAp-EGFP感染細胞，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　將HEK293、K562、Raji三種細胞按照高、低細胞密度鋪板，scAAV2-CBAp-EGFP感染細胞，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。使用含有HSPG、FGFR1熒光抗體，借助流式細胞儀，分析rAAV2受體、共受體在HEK293、K562、Raji細胞表面的表達差異。
　　將人造血干細胞按照高、低細胞密度鋪板，scAAV2-CBAp

9、-EGFP或scAAV6-CBAp-EGFP, scAAV2-4M-CBAp-EGFP或scAAV6-3M-CBAp-EGFP感染細胞，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　（三）蟾毒靈對rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響及機制分析
　　ssAAV2-CBAp-EGFP、scAAV2-CMVp-hrGFP、scAAV2-4M-CBAp-EGFP載體感染HEK293、HeLa細胞，在感染過程中，同時加入DMSO、蟾毒靈、MG132

10、，或?qū)G132與蟾毒靈聯(lián)用，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，WesternBlot方法分析細胞內(nèi)泛素蛋白含量差異。C57小鼠腹腔注射DMSO或蟾毒靈，連續(xù)10天，并在第6天尾靜脈注射ssAAV8-CBAp-fluc-EYFP(1×109vgs)，病毒注射2周后，使用活體成像儀分析rAAV8報告基因的表達。
　?。ㄋ模┳喜菟貙AAV6在人造血細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響及機制分析
　　scAAV6-CBAp-EGFP感染

11、K562細胞，并在感染的過程中，加入DMSO、紫草素、蟾毒靈、MG132、抗氧化劑NAC，或紫草素與NAC聯(lián)合使用，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。scAAV6-CBAp-EGFP、scAAV2-CBAp-EGFP分別感染K562、HEK293細胞，并在感染的過程中，加入蛋白酶體抑制劑、蛋白酶抑制劑等，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。使用DHE染料，借助流式細胞儀分析細胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Spec

12、ies，ROS），用qPCR分析細胞內(nèi)的rAAV基因拷貝數(shù)，Western Blot方法分析細胞內(nèi)泛素蛋白的含量。
　　scAAV6-CBAp-EGFP感染人造血干細胞，在感染的過程中，加入DMSO、紫草素、MG132，使用熒光顯微鏡和流式細胞儀分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　?。ㄎ澹└什菟徜@鹽和五味子素對rAAV穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達效率的影響
　　C57小鼠尾靜脈注射ssAAV2-CBAp-Fluc-EYFP(5×108vgs)、

13、ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP(5×108vgs)、ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP(5×109vgs)或scAAV8-CBAp-Gluc(5×108vgs)。2個月后，小鼠腹腔注射DMSO、甘草酸銨鹽、五味子甲素等，并在注射前后，使用活體成像儀或使用熒光素酶試劑盒檢測報告基因的表達。
　　scAAV2-CBAp-EGFP感染HEK293細胞，24h后，向細胞中加入甘草酸銨鹽和五味子素，使用熒光顯微鏡觀察及流

14、式細胞儀進行分析。
　?。┙y(tǒng)計方法
　　實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差（x±SD）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。在評價蟾毒靈、紫草素、甘草酸銨鹽或五味子素的單因素不同濃度之間的差異時，使用方差分析的方法。分析兩組間差異時，若方差齊，則用Student's t檢驗進行分析;若方差不齊，則使用非參數(shù)方法中的Mann-Whitney U檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　三、研究結(jié)果
　?。ㄒ?/p>

15、）Rep3和ITR3在優(yōu)化rAAV3包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率中的應(yīng)用
　　1.質(zhì)粒的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染效率的分析。反式作用因子Rep2與Rep3蛋白的表達量相近;順式作用元件ITR2與ITR3所介導(dǎo)的目的基因所表達的綠色熒光表達無明顯差別。
　　2.反式作用因子對攜帶有順式作用原件的目的基因的復(fù)制效率的影響。在使用Rep2的情況下，ITR2與ITR3所介導(dǎo)的目的基因的DNA拷貝數(shù)沒有明顯差別;在使用Rep3的情況下，pITR2-CMVp-h

16、rGFP與pITR3-CMVp-hrGFP之間的DNA拷貝數(shù)沒有區(qū)別，但pITR2-CMVp-EGFP-Neo的含量卻明顯低于pITR3-CMVp-EGF-Neo，二者之間具有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.順式作用元件及反式作用因子對rAAV載體包裝效率的影響。與Rep2ITR2包裝出來的ssAAV3-CMVp-EGFP-Neo的數(shù)目相比，Rep2ITR3與之無明顯區(qū)別，Rep3ITR2減少，但Rep3ITR3增加，約為Rep2IT

17、R2組的4.5倍。
　　4.順式作用元件及反式作用因子對包裝出來的rAAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。由Rep2ITR2包裝出來的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo在Huh7、LH86細胞的綠色熒光強度均明顯低于由Rep3ITR3包裝出來的ssAAV3-ITR2-CMVp-EGFP-Neo載體。
　?。ǘ┘毎芏葘AAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響
　　1.細胞密度對rAAV6在K562細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。在固定MO

18、I的情況下，隨著K562細胞密度的增加，熒光陽性細胞百分比、細胞平均熒光強度在一定的范圍內(nèi)隨著細胞密度的增加而增加。
　　K562高細胞密度組中的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度均明顯高于低細胞密度濃縮組;高細胞密度稀釋組的平均熒光陽性細胞百分比、平均熒光強度，明顯高于低細胞密度濃縮組。
　　K562高細胞密度組中的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度均明顯高于低細胞密度組，且高密度細胞組rAAV6的含量為低細胞密度組的4.3倍

19、，二者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　隨著體積的增加，K562熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度逐漸下降，且50μL、500μL組中細胞的病毒拷貝數(shù)均較1mL組明顯高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在K562高細胞密度的情況下，當(dāng)MOI低至300，甚至30時，rAAV6也能順利實現(xiàn)在K562細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　2.細胞密度對rAAV2在HEK293、K562及Raji細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。在相同的MOI和細胞密度的條件下，熒光陽性細胞百分

20、比、細胞熒光強度從高到低的順序分別為HEK293、K562、Raji;在相同MOI的情況下，當(dāng)細胞密度增加時，HEK293細胞熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度不增加，但K562、Raji細胞的細胞熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度卻明顯增加。
　　HEK293細胞中的受體HSPG、共受體FGFR1含量最高，K562細胞中的受體HSPG含量次之，Raji細胞中的受體HSPG含量最低，K562、Raji細胞中的共受體FGFR1含量相當(dāng)。

21、
　　3.細胞密度對rAAV2、rAAV6在人造血干細胞中的影響。在相同的MOI情況下，人造血干細胞高密度細胞組的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度均高于低密度細胞組;在使用相同病毒數(shù)的情況下，高密度細胞組的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度均高于低密度細胞組。
　　rAAV突變體scAAV2-4M-CBAp-EGFP、scAAV6-3M-CBAp-EGFP載體所介導(dǎo)的人造血干細胞的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度分別高于野生型

22、的rAAVscAAV2-CBAp-EGFP、scAAV6-CBAp-EGFP載體。
　　（三）蟾毒靈對rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響及機制分析
　　1.蟾毒靈在體外對rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。與對照組DMSO相比，蟾毒靈作用后HEK293、HeLa細胞的綠色熒光像素明顯增加。
　　2.蟾毒靈在體外提高rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的機制研究。經(jīng)蟾毒靈、MG132處理后的細胞的綠色熒光像素比對照組DMSO處理后的細胞明顯升高，熒光陽性細胞比例、

23、細胞熒光像素增加。當(dāng)二者聯(lián)用后，細胞的綠色熒光像素進一步增加，明顯高于單獨使用蟾毒靈或MG132組。
　　經(jīng)MG132處理后的HeLa細胞中積累的泛素蛋白含量明顯增加，但蟾毒靈處理后的HeLa細胞的泛素蛋白含量與對照組相當(dāng)。
　　3.蟾毒靈在體外對rAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。蟾毒靈處理后的C57小鼠的螢火蟲螢光素酶含量與對照組之間沒有明顯差異。
　?。ㄋ模┳喜菟貙AAV6在人造血細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響及機制分析
　

24、　1.紫草素對rAAV6在K562中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。紫草素作用后的K562細胞的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度最強，且具有一定的劑量依賴趨勢。
　　2.蛋白酶體抑制劑、蛋白酶抑制劑對rAAV6在K562細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。蛋白酶體抑制劑MG132對rAAV2、rAAV6載體在K562細胞的熒光陽性細胞百分比、細胞熒光強度無明顯影響，但卻能夠明顯提高rAAV2、rAAV6在HEK293細胞中的熒光像素?？ǚ亲裘卓梢悦黠@提高rAA

25、V6感染后的K562細胞的細胞熒光強度，對熒光陽性細胞百分比沒有影響。
　　3.紫草素提高rAAV6在K562細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的機制研究?？寡趸瘎㎞AC對rAAV6感染后的K562細胞的細胞熒光陽性細胞比例、細胞熒光強度無明顯影響，但卻可以明顯降低由紫草素所引起的熒光陽性細胞比例、細胞熒光強度升高。紫草素可以增加細胞內(nèi)ROS含量，而在此基礎(chǔ)上聯(lián)用NAC后，細胞內(nèi)ROS含量降低，與DMSO組相當(dāng)。紫草素、紫草素與NAC聯(lián)合對細胞內(nèi)的病

26、毒拷貝數(shù)無影響。卡非佐米、MG132均可以引起細胞內(nèi)的泛素積累，且這種泛素蛋白積累的程度遠高于紫草素。
　　4.紫草素對rAAV6在人造血干細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響。紫草素可以增加人造血細胞的細胞熒光強度，且其作用優(yōu)于MG132。
　?。ㄎ澹└什菟徜@鹽和五味子素對rAAV穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基因表達效率的影響
　　1.提高rAAV穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)后基因表達效率的中藥單體的體內(nèi)篩選。與對照組DMSO相比，甘草酸銨鹽、五味子素注射后，小鼠的螢

27、火蟲螢光素酶含量較注射前明顯升高。
　　2.甘草酸銨鹽和五味子素在體內(nèi)對穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAV的基因表達效率的影響。甘草酸銨鹽、五味子甲素能夠增加低劑量的ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP或scAAV8-CBAp-Gluc(5×108vgs)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠體內(nèi)的螢火蟲螢光素酶或高斯熒光素酶含量，而對高劑量的ssAAV8-CBAp-Fluc-EYFP(5×109vgs)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)后的小鼠的螢火蟲螢光素酶的含量無影響。
　　3

28、.甘草酸銨鹽和五味子素在體外對穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的rAAV的基因表達效率的影響。甘草酸銨鹽和五味子素對穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)scAAV2-CBAp-EGFP的HEK293細胞的基因表達效率無影響。
　　四、研究結(jié)論
　　為進一步增強rAAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，本課題在中醫(yī)理論的理論指導(dǎo)下，借助于中藥種類多、作用靶點廣的優(yōu)勢，進行了中藥單體篩選，并結(jié)合rAAV載體自身優(yōu)化中較少被研究的因素，探究提高rAAV基因治療療效的新方法，取得了一定的研究成果，值得

29、推廣并應(yīng)用。
　　與目前最常用的包裝生產(chǎn)rAAV3所使用的順式作用元件ITR2、反式作用因子Rep2相比，Rep3與ITR3能夠明顯增加rAAV3的包裝效率，且進一步提高病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。在rAAV的過程中，增加細胞密度可以使細胞內(nèi)的rAAV基因組含量增加，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不斷提高，并且這種提高作用對多種懸浮細胞(K562、Raji)、多種血清型（AAV2、AAV6）以及單雙鏈rAAV載體均有效。此外，使用這種提高細胞密度的方法可以有效提高

30、rAAV載體在人造血干細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　通過與目前已經(jīng)被研究證實了具有提高rAAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的中藥單體——雷公藤紅素、扁塑藤素、紫草素等藥物進行比較和篩選，我們發(fā)現(xiàn):蟾毒靈可以在體外提高rAAV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且其機制可能不同于目前報道最多的抑制蛋白酶體活性，但其體內(nèi)療效不佳;紫草素可以通過增加細胞內(nèi)活性氧的途徑，增加rAAV在人造血系統(tǒng)細胞，尤其是人造血干細胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。
　　針對目前關(guān)于如何實現(xiàn)rAAV穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)后的基