FasL基因重組2型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠骨髓來源DC和活性腎臟的研究.pdf

1、目的:利用2型重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)FasL基因轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠骨髓來源DC和活體腎臟，觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)后FasL基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究FasL轉(zhuǎn)基因在同種異體器官移植中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：1．構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pSNAV2.0-FasL-IRES-EGFP，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，獲得載體細(xì)胞株BHK/FasL-IRES-EGFP；2．利用重組1型單純皰疹病毒(HSV1-rc/△UL2)感染載體細(xì)胞，獲得重組腺相關(guān)病毒

2、；3．通過氯仿抽提、冰乙醇沉淀法純化、濃縮重組腺相關(guān)病毒，SDS-PAGE檢測其純度，地高辛標(biāo)記探針點(diǎn)雜交測定其滴度；4．重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)FasL基因轉(zhuǎn)導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠骨髓來源DC，RT-PCR、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡檢測其表達(dá)；5．用生理鹽水或重組腺相關(guān)病毒經(jīng)腎動(dòng)脈灌注大鼠左腎，并使之于左。腎內(nèi)滯留45分鐘，3周、5周、7周后處死大鼠取腎臟標(biāo)本，通過RT-PCR、HE染色和ICH，檢測FasL表達(dá)以及評(píng)價(jià)腎臟的組織形態(tài)變化。

3、 結(jié)果: 1．成功構(gòu)建了穿梭質(zhì)粒pSNAV2．0-FasL-IRES-EGFP； 2．獲得了重組腺相關(guān)病毒，經(jīng)純化、濃縮后，SDS-PAGE檢測其純度達(dá)98％以上，地高辛標(biāo)記點(diǎn)雜交測定其滴度為1×10<'12>vg/ml； 3．rAAV2-FasL-IRES-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠骨髓來源的DC，48小時(shí)后才可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，隨著時(shí)間的延長逐漸增多，至第7天左右，到達(dá)高峰，以后維持這一水平；通過流式細(xì)胞

4、儀檢測最高峰時(shí)DC表面GFP的表達(dá)效率為18％左右；同時(shí)通過RT-PCR也證實(shí)了FasL基因的表達(dá)； 4．rAAV2-FasL-IRES-EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)活體腎臟后，HE染色證實(shí)其未引起腎臟組織的異常形態(tài)學(xué)改變；RT-PCR和ICH證實(shí)了FasL 基因表達(dá)但局限于腎小管上皮細(xì)胞。 結(jié)論 1．成功制備了FasL基因重組2型腺相關(guān)病毒； 2．rAAV介導(dǎo)的FasL基因成功轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠骨髓來源的DC，效率較低，但基因的