慢病毒系統(tǒng)HBV基因可調(diào)控表達(dá)細(xì)胞模型的構(gòu)建.pdf

1、乙型病毒性肝炎(hepatitis B，HB)是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的世界范圍內(nèi)流行的一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。HBV感染后，有相當(dāng)部分的患者最終將轉(zhuǎn)化為慢性肝病，并發(fā)肝硬化和原發(fā)性肝癌。以往用于HBV研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ投酁镠epG2細(xì)胞，HCC組織及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等模型，這些模型中HBV DNA均已穩(wěn)定的整合入肝細(xì)胞的基因組，是一種與宿主細(xì)胞靜態(tài)相容的結(jié)果，不能反映病毒感染過程中細(xì)胞中動(dòng)態(tài)變化過程，以作為觀察研究病毒抗原與宿主互作的

2、研究模型。為此我們選用四環(huán)素調(diào)控的慢病毒系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)乙肝病毒基因的可調(diào)控表達(dá)，通過人為的控制可觀察不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的整體變化情況。
　　研究中，我們構(gòu)建了含有乙肝病毒基因(X，P，C，preC-C，S，preS2-S，PreS1-S2-S)的七種可誘導(dǎo)表達(dá)載體質(zhì)粒，經(jīng)鑒定DNA序列正確。利用慢病毒包裝細(xì)胞系HEK293T細(xì)胞分別獲得含有調(diào)控質(zhì)粒pLVX-Tet-On和表達(dá)質(zhì)粒pLVX-GOI的病毒顆粒，滴度達(dá)到可108LPs/ml。將

3、這兩種病毒共感染HepG2和L02細(xì)胞株，并利用雙重抗生素篩選(G418和Puromycin)獲得整合有目的基因的穩(wěn)定細(xì)胞株。隨后，對于構(gòu)建的細(xì)胞株中目的基因的存在進(jìn)行了鑒定，并對其中含有X和PreS1-S2-S的細(xì)胞株HepG2-X/LS誘導(dǎo)表達(dá)的RNA進(jìn)行鑒定，證明獲得可誘導(dǎo)表達(dá)的mRNA，進(jìn)一步對X轉(zhuǎn)基因細(xì)胞HepG2-X進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)物X蛋白鑒定，證明獲得了X蛋白可誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞株。HBV基因可調(diào)控細(xì)胞模型的構(gòu)建，為進(jìn)一步研究HBV