靶向hTERT可調(diào)控慢病毒載體RNAi治療口腔鱗癌的研究.pdf

1、目的:理想化的腫瘤治療是以多學(xué)科綜合治療的手段達(dá)到延長(zhǎng)患者生存時(shí)間和改善患者生存質(zhì)量的目的。鱗狀細(xì)胞癌是頭頸—口腔頜面部最多發(fā)惡性腫瘤，目前臨床主要是采取以外科手術(shù)為主，輔以化、放療等多種方法的治療模式，但腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移往往導(dǎo)致治療失敗。在外科術(shù)式日臻成熟的今天，頭頸—口腔頜面部惡性腫瘤治療的遠(yuǎn)期效果即5年期生存率卻無(wú)明顯改善，外科手術(shù)不可避免會(huì)導(dǎo)致患者不同程度的顏面部缺損、畸形和相應(yīng)功能障礙、身心創(chuàng)傷。探索其它配合治療手段有

2、望進(jìn)一步提升口腔鱗癌的治療效果。腫瘤是涉及多種基因、多步驟改變的基因疾病，因此，在研究腫瘤發(fā)病的分子機(jī)制基礎(chǔ)上，基因治療作為對(duì)因治療，是最終征服癌癥的希望所在，作為一種新的疾病治療手段，基因治療將改變?nèi)祟惣膊≈委煹臍v史進(jìn)程。 RNA干擾(RNAi)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達(dá)的一種現(xiàn)象：當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時(shí)，在核酸酶Dicer作用下可將長(zhǎng)雙鏈RNA降解為21-23bp的小分子干擾RNA(siRNAs

3、)，siRNAs結(jié)合其他元件形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISCs)，結(jié)合并切割mRNA，敲減目的基因的表達(dá)，達(dá)到基因沉默效果。RNAi具有高度特異性、高效性，相對(duì)安全、簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為研究基因功能的重要工具，并將在臨床應(yīng)用等眾多領(lǐng)域取得突破性成果。 惡性腫瘤的一個(gè)重要特征是細(xì)胞永生化，端粒和端粒酶作為維持染色體的穩(wěn)定的主要結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壽命的“生物鐘”，特別是端粒酶活性的主要限速性組分：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)在超過(guò)85％

4、以上的惡性腫瘤(包括頭頸—口腔頜面部鱗狀細(xì)胞癌)細(xì)胞中特異性的持續(xù)表達(dá)可視為腫瘤細(xì)胞永生化、增殖性增強(qiáng)的關(guān)鍵因素，可望作為腫瘤鑒別診斷、基因治療的理想靶標(biāo)。 基因治療的關(guān)鍵和基礎(chǔ)是基因轉(zhuǎn)移，目的基因?qū)氚屑?xì)胞并使之表達(dá)是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；蜣D(zhuǎn)移的非病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移方法效率較低，人體實(shí)驗(yàn)的基因治療方案絕大多數(shù)是以病毒學(xué)方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的。基于人類免疫缺陷癥病毒(HIV-1)基礎(chǔ)上制備的慢病毒載體已發(fā)展成為一種高效、安全的基因載體。慢病

5、毒載體具有諸多優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)移基因片段容量大、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)；不僅能感染分裂細(xì)胞，還能用于感染不分裂細(xì)胞；可穩(wěn)定整合于靶細(xì)胞的基因組，能在多種組織、器官中介導(dǎo)長(zhǎng)期而穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，治療基因表達(dá)時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)六個(gè)月之久。慢病毒載體系統(tǒng)經(jīng)歷了10余年4個(gè)階段發(fā)展：在構(gòu)建時(shí)把HIV-1基因組中進(jìn)行包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件與編碼反式作用蛋白的序列分離，分別構(gòu)建在三個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)上，即包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒；并在包裝質(zhì)粒中刪

6、去了HIV-1的所有附屬基因；刪除了U3區(qū)的3'LTR，使載體失去HIV-1增強(qiáng)子及啟動(dòng)子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能轉(zhuǎn)錄出RNA；去除了tat基因代之以異源啟動(dòng)子序列，這樣原始的HIV基因組中的9個(gè)基因在制備的HIV慢病毒載體中只保留了3個(gè)(gag、pol和rev)；最后加入調(diào)控元件形成可誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。三質(zhì)粒系統(tǒng)通過(guò)共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞便能收獲只有一次感染能力、而無(wú)復(fù)制能力、具有自身失活特性的病毒載體顆粒。 目前基因治療中

7、的另一前沿課題便是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的可調(diào)控性?？烧{(diào)控轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)是指在基因表達(dá)體系中設(shè)計(jì)加入特定的誘導(dǎo)劑反應(yīng)元件，可在外源信號(hào)或者藥物的誘導(dǎo)下激活，開(kāi)啟或關(guān)閉后續(xù)目的基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。在利用RNAi進(jìn)行真核基因功能研究和治療目的時(shí)，多數(shù)轉(zhuǎn)基因都是持續(xù)表達(dá)的，沒(méi)有表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間的調(diào)控，這種持續(xù)表達(dá)不論是在基因功能研究還是基因治療都存在很大的局限。如果對(duì)RNA沉默加以調(diào)控，設(shè)置開(kāi)關(guān)，就可對(duì)選定靶基因的“開(kāi)”、“關(guān)”(on/off)表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行比對(duì)

8、研究，從而準(zhǔn)確獲得靶基因的功能分析。因此可調(diào)控、可誘導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為是未來(lái)RNAi的重要發(fā)展方向。理想化的可調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)是目標(biāo)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)后，在外源信號(hào)或者藥物的誘導(dǎo)下在適當(dāng)時(shí)機(jī)開(kāi)啟，按照施與誘導(dǎo)劑的劑量、時(shí)間依賴性進(jìn)行精確的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使其在治療過(guò)程中根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)劑量，并可在治療成功或出現(xiàn)毒副作用時(shí)隨時(shí)終止。 本課題組前期應(yīng)用PAMAM—D納米載體介導(dǎo)靶向hTERTsiRNA成功轉(zhuǎn)染人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞獲得良好

9、敲減效果，在此基礎(chǔ)上，本研究針對(duì)hTERT設(shè)計(jì)5條候選序列，篩選其中有效shRNA序列，制備慢病毒轉(zhuǎn)基因載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)人口腔鱗癌細(xì)胞系：KB細(xì)胞，探索該系統(tǒng)的包裝流程、體外轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、特異性敲減效能和相關(guān)抑瘤機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上制備強(qiáng)力霉素(Doxycycline)誘導(dǎo)可調(diào)控慢病毒載體系統(tǒng)，初步研究其對(duì)誘導(dǎo)信號(hào)的時(shí)間、劑量依從性及其對(duì)hTERT基因的敲減效能。 本文分以下三部分： 第一部分靶向hTERTRNAi質(zhì)粒載體的制備與有

10、效靶點(diǎn)篩選的研究； 第二部分靶向hTERT慢病毒載體RNAi系統(tǒng)制備及其治療口腔鱗癌的研究； 第三部分靶向hTERT可調(diào)控慢病毒載體RNAi系統(tǒng)制備及其治療口腔鱗癌的研究。 得出以下結(jié)論： 1.以5'—GCAAGTTGCAAAGCATTGGAA—3'序列設(shè)計(jì)的RNAi可有效、特異性地沉默hTERT基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。 2.構(gòu)建外源基因的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞可作為RNAi敲減效率篩選的驗(yàn)績(jī)標(biāo)

11、靶。 3.成功制備靶向hTERTRNAi慢病毒載體，病毒滴度：5.0×107TU/ml。該慢病毒轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可有效轉(zhuǎn)染人口腔鱗癌KB細(xì)胞株；最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)條件MOI為2.5。 4.轉(zhuǎn)導(dǎo)Day5thhTERTmRNA表達(dá)水平特異性下降：73.42％，hTERT蛋白表達(dá)下調(diào)：74.67％；Day10thhTERT蛋白表達(dá)下調(diào)：82.91％。 5.轉(zhuǎn)導(dǎo)Day5thCyclinD1mRNA表達(dá)水平下調(diào)：54.67％；Caspas

12、e—3上調(diào)：100.10％；Caspase—9表達(dá)上調(diào)：42.67％；細(xì)胞凋亡率水平上調(diào)206.33％。 6.成功制備調(diào)控蛋白KRAB過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并可在293T細(xì)胞中有效表達(dá)KRAB蛋白。成功制備Tet—ON可調(diào)控靶向hTERTRNAi慢病毒載體，病毒滴度：2.5×108TU/ml。 7.KRAB過(guò)表達(dá)慢病毒載體與Tet—ON可調(diào)控靶向hTERTRNAi慢病毒載體按1:1比例(MOI=2.5)共轉(zhuǎn)導(dǎo)KB細(xì)胞，hTE

13、RT蛋白表達(dá)敲減效能與誘導(dǎo)劑強(qiáng)力霉素Dox呈現(xiàn)明顯劑量、作用時(shí)間依賴性：當(dāng)未施加Dox誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，hTERT蛋白表達(dá)量?jī)H有微量下調(diào)，可能為極低水平的“漏表達(dá)”所致；0.1μg/ml—4d、2.0μg/ml-12h可視為本調(diào)控系統(tǒng)的誘導(dǎo)劑初始閾值；在誘導(dǎo)劑達(dá)到2.0-4.0μg/ml—4d、2.0μg/ml—96h濃度—作用時(shí)間范圍時(shí)基本達(dá)到第二階段非調(diào)控慢病毒RNAi系統(tǒng)相應(yīng)作用時(shí)間點(diǎn)的敲減水平(80％)，提示在此誘導(dǎo)劑濃度下，Tet—