攜帶可調(diào)控β-內(nèi)啡肽基因的腺病毒治療疼痛的研究.pdf

1、研究背景及目的: 前期研究證實(shí)，椎管內(nèi)單次注射攜帶神經(jīng)生長(zhǎng)因子前導(dǎo)肽-β-內(nèi)啡肽融合基因（NEP）的第一代腺病毒能夠有效減輕神經(jīng)病理性疼痛，但是持續(xù)表達(dá)的β-內(nèi)啡肽是否會(huì)出現(xiàn)蓄積過(guò)量仍有疑慮，而且第一代腺病毒免疫原性高，β-內(nèi)啡肽無(wú)法長(zhǎng)期表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)中我們擬構(gòu)建RU486可調(diào)控NEP基因的第一代腺病毒，并進(jìn)行體外驗(yàn)證；同時(shí)試行構(gòu)建RU486可調(diào)控NEP基因的第三代腺病毒載體。 方法: 1.構(gòu)建由RU486

2、可調(diào)控NEP基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-RUNEP，同時(shí)分別構(gòu)建攜帶報(bào)告基因RFP或 LUC質(zhì)粒pDC312-RURED與pDC312-RULUC，以及僅攜帶NEP的穿梭質(zhì)粒pDC316-NEP； 2.利用AdMAXTM 系統(tǒng)，重組得到第一代腺病毒Ad-RUNEP和Ad-NEP，進(jìn)行擴(kuò)增、純化和測(cè)定滴度； 3.穿梭質(zhì)粒pDC312-RURED和pDC312-RULUC分別脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，檢測(cè)RU48

3、6調(diào)控系統(tǒng)的功能； 4.腺病毒Ad-RUNEP感染NIH3T3 和A431，加入不同劑量梯度的RU486，兩天后去除RU486誘導(dǎo)， ELISA定量檢測(cè)加入RU486之后第1、2和4天每一樣本培養(yǎng)上清中β-內(nèi)啡肽的表達(dá)含量，使用Ad-NEP作對(duì)照； 5.利用Gateway○R系統(tǒng)同源重組法，重組構(gòu)建第三代腺病毒載體pGL-RUNEP； 6.利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)結(jié)果。 結(jié)果: 1.

4、得到滴度為2.25×1010PFU/ml的第一代腺病毒Ad-RUNEP； 2.RU486調(diào)控系統(tǒng)的檢測(cè)： RFP和LUC的表達(dá)都會(huì)隨RU486呈劑量依賴性增加； 3.ELISA定量檢測(cè)：當(dāng)RU486劑量達(dá)10-7mol/l時(shí)，β-內(nèi)啡肽的表達(dá)也達(dá)到最大，并且隨RU486的給藥停止而減弱； 4.成功構(gòu)建得第三代腺病毒載體pGL-RUNEP。 結(jié)論: 我們已成功構(gòu)建攜帶RU486可調(diào)控NEP基