靶向hTERT和IL-2的天平式雙向基因治療載體構(gòu)建的研究.pdf

1、近些年，基因治療已經(jīng)成為治療腫瘤的一種新思路和新方法[1]?；蛑委焄2,3]就是利用基因轉(zhuǎn)移和基因重組的技術(shù)，將構(gòu)建好的外源性治療基因有效的導(dǎo)入到細胞內(nèi)，導(dǎo)入基因可以起到直接修復(fù)和糾正，與腫瘤發(fā)病相關(guān)的基因，從而達到治療腫瘤的目的。
　　腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是由多個基因相互聯(lián)系而形成的復(fù)雜疾病，是由基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的，其特點是多因素多環(huán)節(jié)與多階段[4]。隨著乳腺癌研究的不斷深入，乳腺局部微環(huán)境在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)逐漸引起了人們

2、的重視[5]。因此考慮使用聯(lián)合基因治療[6]可以更好的抵制乳腺癌細胞，本課題就是要考察基因沉默治療和免疫基因治療的聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌的抗腫瘤作用。
　　本實驗首先利用PCR技術(shù)擴增出人的 IL-2基因，然后將 IL-2基因插入到pEGFP-C1載體上，構(gòu)建了載體pEGFP-IL2，繼而把重組質(zhì)粒pEGFP-IL2轉(zhuǎn)染到乳腺癌MCF-7細胞中，通過考察綠色熒光蛋白的表達量估算載體的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)錄水平；同時還構(gòu)建了 hTERT的基因沉默

3、（ RNAi）表達載體，命名為pEGFP-shTERT；接著，將IL-2基因插入到pEGFP-shTERT載體上，構(gòu)建成雙基因表達載體pEGFP-IL2-TERT。然后用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine20000分別將三種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞，考察重組質(zhì)粒對乳腺癌細胞增殖、凋亡、周期的影響。以及三種重組質(zhì)粒抗腫瘤作用的比較，通過體外細胞實驗我們看出雙基因載體pEGFP-IL2-TERT抗腫瘤活性最強，重組載體pEGFP-s

4、hTERT比雙基因載體的抗腫瘤活性弱但比重組子 pEGFP-IL2抗腫瘤活性強，可能是免疫治療基因只有在完整的生物機體內(nèi)才可以發(fā)揮充分的抗腫瘤活性。
　　細胞凋亡檢測顯示，單基因組可以不同程度的誘導(dǎo)細胞的凋亡，其中雙基因調(diào)控載體 pEGFP-IL2-TERT組的細胞凋亡率比單基因組細胞凋亡率要高。細胞周期結(jié)果顯示，單基因組載體對細胞的阻滯在 G2期，G2期的相對百分比分別提高了79.38％和119.08%；而雙基因組對細胞阻滯在

5、G2相對百分比提高159.23%和S期相對百分比提高了57.23%。
　　基于細胞學(xué)研究，進行重組載體裸鼠移植瘤MCF-7細胞研究。將經(jīng)轉(zhuǎn)染重組載體的細胞和正常細胞分別接種5 w的雌性裸鼠，利用RT-PCR檢測瘤組織內(nèi)TERT mRNA的表達；制作生理切片觀察重組質(zhì)粒對瘤組織細胞形態(tài)的影響。最終雙基因組的抑瘤率達到63.27%， pEGFP-IL2對荷瘤小鼠的腫瘤抑制率為29.8%、pEGFP-shTERT對荷瘤小鼠的腫瘤抑制率為

6、53.9%；pEGFP-IL2組瘤體內(nèi)TERT的表達變化不大，pEGFP-shTERT組和雙基因組瘤體內(nèi)TERT的表達下降；瘤組織的石蠟切片的HE染色果顯示，雙基因載體pEGFP-IL2-shTERT轉(zhuǎn)染對腫瘤組織細胞有較強的抑制作用。
　　通過與單基因組IL-2組和hTERT的RNAi組的比較，雙基因組載體在上調(diào)IL-2基因的同時下調(diào)了TERT基因的表達，可以有效的抑制細胞內(nèi)和移植瘤內(nèi)的TERT mRNA的表達，引起細胞凋亡、影