Notch-Dll4和VEGF信號通路在急性髓性白血病血管新生中的交互作用及機制研究.pdf

1、第一部分
　　 Notch/Dll4和VEGF信號通路在急性髓性白血病中的表達及臨床意義
　　 研究背景:
　　 血管新生是指在原有血管基礎上芽生出新的血管、廣泛重建后形成穩(wěn)定血管網(wǎng)絡的復雜過程，在實體腫瘤的生長、轉移及預后中發(fā)揮重要作用。越來越多的研究表明，骨髓微血管密度增多（即骨髓血管新生）對急性髓性白血病(AML)的發(fā)展、化療耐藥和預后亦有重要意義。AML骨髓微環(huán)境中血管生成刺激因子（正調(diào)節(jié)）和血管生成抑制

2、因子（負調(diào)節(jié)）的相對平衡，可控制骨髓血管生成開關，從而調(diào)控AML血管新生。其中，血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)和Notch/Dll4信號通路可能是調(diào)節(jié)AML血管新生的兩個最重要機制。
　　 VEGF信號通路是調(diào)節(jié)胚胎血管發(fā)育和腫瘤血管新生的主要信號通路，對血管發(fā)育的啟動至關重要。AML中VEGF的表達失調(diào)不僅可促進血管新生，還能刺激AML細胞增殖、遷移。研究顯示，在初診AML患者中可檢測到VEGF和VEGFR2表達上調(diào)，且其高

3、表達的AML患者易出現(xiàn)化療藥物抵抗、預后較差，提示VEGF信號通路與AML的發(fā)生、發(fā)展及預后關系密切。
　　 最近研究顯示，Notch信號通路，尤其是Notch配體Dll4是另一調(diào)節(jié)腫瘤血管新生的重要信號通路。Notch信號通路在細胞增殖和分化等命運決定中起關鍵作用，其異常調(diào)控可導致腫瘤等多種疾病的發(fā)生。Dll4介導的Notch信號通路活化對腫瘤細胞與鄰近內(nèi)皮細胞的相互作用也有重要意義，可能在AML血管新生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

4、研究表明，根據(jù)腫瘤的組織來源和細胞類型，Notch/Dll4信號通路可發(fā)揮促進或抑制血管新生的作用。此外，該信號通路對不同腫瘤的預后影響亦存在很大差異，可能起促癌或抑癌作用。因此，闡明Notch/Dll4信號通路在AML中的預后價值對抗AML血管新生治療具有重要意義。
　　 研究顯示VEGF信號通路在血管新生中起促進作用;Notch/Dll4信號通路則能促進血管成熟、阻斷新生血管分支形成，抑制血管的過度增生，從而發(fā)揮負調(diào)節(jié)作用，

5、提示在AML血管新生中可能同時存在這兩條正、負信號調(diào)節(jié)通路。因此，只有在VEGF和Notch/Dll4信號通路的協(xié)調(diào)作用下，AML血管新生才能有序進行。綜上所述，AML細胞和骨髓微環(huán)境中的內(nèi)皮細胞均能分泌多種血管調(diào)節(jié)因子，并且AML血管新生依賴于這些血管調(diào)節(jié)因子的相互協(xié)調(diào)作用。因此，明確AML中血管調(diào)節(jié)因子的相互關系及臨床預后意義，可揭示AML血管新生的分子病理機制，為抗AML血管新生的治療提供新思路。
　　 研究目的:

6、　　 研究Notch/Dll4和VEGF信號通路分子(Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2)在AML患者外周血和骨髓中的表達水平;探討Notch/Dll4和VEGF信號通路在AML血管新生中的相互關系及臨床意義;闡明Notch1和Dll4分子異常表達對AML患者的預后影響，為AML提供新的預后指標。
　　 研究方法:
　　 1.標本采集:收集122例AML患者和40例健康志愿者的外周血

7、標本，分為初診組（60例）和完全緩解組（62例）;收集60例初診AML患者和40例健康志愿者的骨髓標本;收集8例初診AML患者和5例健康志愿者的骨髓活檢標本，所有初診AML患者的骨髓活檢標本中原始細胞比例大于50％。采用差速離心法分離外周血血清，采用淋巴細胞分離液分離外周血或骨髓單個核細胞。
　　 2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法:血清離心去除細胞碎片，分裝并儲存于-20℃，應用ELISA方法檢測血清中VEGF、VEGFR1

8、和VEGFR2蛋白的分泌。
　　 3.實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Real-timeRT-PCR)法:采用TRIzol提取細胞總RNA，使用M-MuLV逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，應用Real-timeRT-PCR方法檢測外周血或骨髓單個核細胞中Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2基因mRNA水平的表達。
　　 4.Westernblot法:采用細胞裂解液RIPA提取細胞總蛋白

9、，SDS-PAGE膠進行凝膠電泳，應用Westernblot方法檢測外周血或骨髓單個核細胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表達。
　　 5.免疫細胞化學(ICC)法:將外周血單個核細胞懸液吹勻，滴加在多聚賴氨酸包被處理的玻片上，多聚甲醛固定，應用ICC方法檢測外周血單個核細胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白水平的表達。
　　 6.免疫組織化學(IHC)法:應用IHC方法檢測骨髓活檢組織中CD34蛋白水平

10、的表達，即為骨髓微血管密度(MVD)，評價骨髓血管新生的程度;應用IHC方法檢測骨髓活檢組織中Dll4和VEGF蛋白水平的表達。分析骨髓MVD與Dll4、VEGF蛋白表達的關系。
　　 7.統(tǒng)計分析:應用Mann-WhitneyU檢驗、方差分析、Kruskal-Wallis檢驗分析AML患者組和對照組中Notch1、Dll4、Hes1、VEGF、VEGFR1和VEGFR2等血管調(diào)節(jié)因子的表達差異;應用Spearman秩相關分析各

11、個血管調(diào)節(jié)因子表達的相關性、血管調(diào)節(jié)因子表達和臨床特征的相關性;應用Kaplan-Meier生存曲線評估各組AML患者的生存率，log-rank檢驗比較組間生存率差異;應用單因素Cox比例風險回歸模型評價各個因素對生存的預后影響，多因素Cox比例風險回歸模型確定與生存相關的獨立危險因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 研究結果:
　　 1.Notch/Dll4和VEGF信號通路分子在AML患者外周血標本中的表達:

12、
　　 ①ELISA結果顯示AML完全緩解組中血清VEGF濃度明顯高于對照組，而初診組中血清VEGF濃度明顯低于完全緩解組，初診組中血清VEGFR1、VEGFR2濃度明顯高于對照組;
　　 ②Real-timeRT-PCR結果顯示初診AML患者外周血單個核細胞中Notch1、Dll4、Hes1和VEGFR2基因mRNA表達水平明顯高于對照組，而初診AML患者外周血單個核細胞中VEGF和VEGFR1基因mRNA表達水平與對

13、照組無顯著差異;
　　 ③Westernblot和ICC結果顯示初診AML患者外周血單個核細胞中Notch1、Dll4和Hes1蛋白表達水平亦明顯高于對照組;
　　 ④Spearman秩相關分析結果顯示初診AML患者外周血Notch1與VEGFR2、Dll4與VEGFR2的mRNA表達顯著相關，相關系數(shù)分別為0.483和0.426，表明AML患者外周血中存在Notch/Dll4和VEGF信號通路的異常激活。
　　

14、 2.Notch/Dll4和VEGF信號通路分子在AML患者骨髓標本中的表達:
　　 ①Real-timeRT-PCR結果顯示初診AML患者骨髓單個核細胞中Notch1、Dll4、VEGF和VEGFR2基因mRNA表達水平明顯高于對照組，而初診AML患者骨髓單個核細胞中VEGFR1基因mRNA表達水平與對照組無顯著差異;
　　 ②Westemblot結果顯示初診AML患者骨髓單個核細胞中Notch1和Dll4蛋白表達水平

15、亦明顯高于對照組;
　　 ③Spearman秩相關分析結果顯示初診AML患者骨髓Notch1與Dll4、VEGF與VEGFR2、Dll4與VEGF的mRNA表達顯著相關，相關系數(shù)分別為0.326、0.354和0.663，表明AML患者骨髓中存在Notch/Dll4和VEGF信號通路的異常激活。
　　 3.AⅥL患者骨髓MVD及其與Dll4和VEGF蛋白表達的關系:
　　 ①IHC結果顯示初診AML患者骨髓MVD較

16、對照組明顯增高;初診AML患者骨髓Dll4和VEGF蛋白的表達水平較對照組亦明顯增高，分別為1.27-4.63和1.49-2.92倍;
　　 ②Spearman秩相關分析結果顯示骨髓MVD與Dll4和VEGF蛋白的表達顯著相關，相關系數(shù)分別為0.858和0.816，表明初診AML患者骨髓MVD顯著增加，且其與骨髓Dll4和VEGF蛋白的高表達呈正相關。
　　 4.AML患者骨髓標本中Notch/Dll4和VEGF信號通路

17、分子表達與臨床特征的相關性:
　　 ①Spearman秩相關分析結果顯示骨髓Notch1、Dll4和VEGF的mRNA表達水平與AML骨髓原始細胞比例顯著相關，相關系數(shù)分別為0.428、0.288和0.428;
　　 ②方差分析結果顯示細胞遺傳學各亞組間骨髓Dll4和VEGF的mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義，而Notch/Dll4和VEGF信號通路分子的mRNA表達水平與性別、年齡及FAB分型無關。
　　 5.AM

18、L患者骨髓標本中Notch/Dll4和VEGF信號通路分子表達與臨床預后的相關性:
　　 ①AML患者的中位總生存期(OS)為25個月;
　　 ②單因素Cox比例風險回歸模型顯示不良染色體核型、Notch1高表達、Dll4高表達或VEGF高表達的AML患者OS較短，多因素Cox比例風險回歸模型顯示染色體核型及Notch1、Dll4和VEGF的表達水平是影響AML患者OS的獨立危險因素;
　　 ③Kaplan-Me

19、ier生存曲線顯示Dll4表達的預后價值在細胞遺傳學中危組AML患者中更為顯著。Notch1和Dll4表達水平是VEGF高表達AML患者的不利預后因素。
　　 結論:
　　 1.AML患者中存在Notch/Dll4和VEGF信號通路的異?；罨?，提示這兩條信號通路可能在AML發(fā)生、發(fā)展中起作用。
　　 2.AML患者中Dll4和VEGF蛋白的異常高表達與骨髓微血管密度增高相關，提示Dll4和VEGF可能在AML血管