WAVE1在兒童急性髓細(xì)胞白血病多藥耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、白血病是兒童最常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，化療是當(dāng)前主要的治療方法。白血病化療失敗的主要原因之一是多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)的發(fā)生，尤其在兒童急性髓細(xì)胞白血病(AML)中更為突出。而且多藥耐藥的發(fā)生嚴(yán)重限制患兒長期無事件生存率。因此，揭示MDR的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療干預(yù)靶點(diǎn)，對(duì)于防治兒童白血病具有重要意義。WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP—family verprolin homologous p

2、rotein1，WAVEl)為肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白，在肌動(dòng)蛋白聚合和細(xì)胞骨架重排中發(fā)揮重要作用。項(xiàng)目組前期研究中發(fā)現(xiàn)WAVEl是白血病細(xì)胞中一新型抗凋亡蛋白，并與白血病K562/A02細(xì)胞系的多藥耐藥發(fā)生密切相關(guān)。
　　 本研究首先收集AML患兒的BMMCs，通過實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡方法(Western blotting)對(duì)52例AML患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMCs)中WAVEl、P-糖蛋白(P—glycoprotein，P-g

3、P)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(Multiple resistance-associated protein-1，MRPl)、肺耐藥蛋白(lung—resistance related protein，LRP)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancerresistance protein，BCRP)的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果顯示復(fù)發(fā)/難治組AML的WAVEl及耐藥相關(guān)基因表達(dá)水平顯著高于緩解組患兒，而且同一患兒初治及復(fù)發(fā)時(shí)的WAVEl基

4、因表達(dá)水平明顯高于緩解期，表明WAVEl表達(dá)水平與AML的預(yù)后和疾病活動(dòng)程度相關(guān)。進(jìn)一步利用白血病HL60，K562及其耐藥細(xì)胞系，分析了WAVEl對(duì)P-gP、MRPl和BCRP表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)WAVE1能夠增加K562細(xì)胞系P-gP的表達(dá)，HL60細(xì)胞系MRP1和BCRP的表達(dá)。相反，采用RNA干擾技術(shù)降低K562/A02和HL60/ADR耐藥細(xì)胞系巾WAVE1的蛋白表達(dá)，能顯著下調(diào)這些細(xì)胞系中耐藥相關(guān)基因P-gp，MRP1和BC

5、RP的表達(dá)水平。
　　 為進(jìn)一步探討WAVE1影響P-gp等耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的機(jī)制，本研究以WAVE1蛋白為誘餌，采用抗WAVE1抗體免疫沉淀白血病細(xì)胞中的WAVE1結(jié)合蛋白，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)技術(shù)對(duì)含有WAVE1結(jié)合蛋白的復(fù)合物進(jìn)行分離，最后采用電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI—Q-TOF)結(jié)合數(shù)據(jù)庫查詢鑒定白血病細(xì)胞中WAVE1的結(jié)合蛋白，提示W(wǎng)AVE1與埃茲蛋白(Ezrin)存在結(jié)合。同

6、時(shí)通過質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)和鑒定了白血病細(xì)胞中43個(gè)可能與‘WAVE1具有直接結(jié)合的蛋白質(zhì)，這些蛋白主要包含了腫瘤相關(guān)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白、受體、代謝相關(guān)酶、免疫相關(guān)蛋白、膜及離子通道蛋白和信號(hào)通路蛋白。
　　 為進(jìn)一步證實(shí)WAVE1—Ezrin-P-gp之問的相互作用，本研究通過活細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證明了WAVE1和Ezrin存在空間位置上的共分布。通過基因轉(zhuǎn)染和干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)AVE1基因后可使Ezrin及P-gp表達(dá)

7、升高，同時(shí)降低了K562細(xì)胞對(duì)阿霉素(ADM)的敏感性；而在高表達(dá)WAVE1的同時(shí)，沉默Ezrin基因的表達(dá)，P-gp水平并不能明顯增加，而且K562細(xì)胞對(duì).ADM的耐藥性也沒有明顯改變，表明WAVE1對(duì)P-gp表達(dá)的影響主要是通過Ezrin介導(dǎo)。在降低Ezrin表達(dá)的同時(shí)，白血病細(xì)胞系中WAVE1表達(dá)并不能明顯降低，進(jìn)一步提示Ezrin為WAVE1的下游效應(yīng)蛋白，而不是WAVE1上游調(diào)控蛋白。因此，WAVE1對(duì)白血病細(xì)胞耐藥性的影響主

8、要是通過Ezrin來完成的。
　　 最后，本研究通過免疫磁珠分選出白血病細(xì)胞系和AML患兒BMMCs中的CD34陽性(CD34+)和CD34陰性(CD34-)細(xì)胞，通過Western blotting分析發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞的WAVE1表達(dá)水平明顯高于CD34細(xì)胞，提示W(wǎng)AVE1可能參與了造血干細(xì)胞的分化成熟與白血病干細(xì)胞的惡性克隆。
　　 綜上所述，細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白WAVE1參與了兒童.AML發(fā)病及多藥耐藥的形成，WAV