急性髓性白血病多藥耐藥基因芯片的構(gòu)建.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血病(AcuteMyelogenousLeukemia，AML)治療的主要手段是化療，而臨床上多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR)已成為化療失敗的主要原因。目前嘗試逆轉(zhuǎn)MDR的結(jié)果尚不理想，因此盡早準(zhǔn)確預(yù)測(cè)MDR的發(fā)生，及時(shí)指導(dǎo)臨床調(diào)整治療是MDR研究的主要目的之一。 MDR是多因素多機(jī)制共同作用的結(jié)果，目前公認(rèn)的主要機(jī)制之一是耐藥相關(guān)基因的異常表達(dá)。例如，MDR1(multidrugresis

2、tancegene1)基因編碼PgP(P-glycoprotein，P糖蛋白)，與化療效果相關(guān)，可作為AML等血液腫瘤預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)和預(yù)后，評(píng)估逆轉(zhuǎn)MDR策略的重要指標(biāo)。多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrugresistance-associatedprotein,MRP)基因也具有賦予MDR表型的能力，和Pgp的耐藥機(jī)制有所不同；MRP單獨(dú)表達(dá)對(duì)化療效果和預(yù)后的影響還不十分明確，但MRP基因和其它耐藥基因聯(lián)合表達(dá)對(duì)AML的療效和預(yù)后則是一個(gè)很

3、強(qiáng)的不良信號(hào)。肺耐藥相關(guān)蛋白(Lungresistanceprotein，LRP)可能通過(guò)核靶點(diǎn)屏蔽等機(jī)制引起MDR，其基因表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞化療耐藥有關(guān)，有研究表明LRP在AML中也是一個(gè)影響化療敏感性和預(yù)后的獨(dú)立因子，在體外預(yù)測(cè)MDR比PgP和MRP都要好。乳腺癌耐藥蛋白(breastcancerresistanceprotein，BCRP)基因過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致臨床化療耐藥，是AML患者預(yù)后的重要不良因素。B細(xì)胞淋巴瘤白血病基因2(B

4、-celllymphoma-leukemia-2gene，Bcl-2)是凋亡抑制基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其高表達(dá)與許多抗白血病藥物的耐藥和臨床白血病難治、復(fù)發(fā)有關(guān)，越來(lái)越受到學(xué)者們的重視。 對(duì)MDR相關(guān)基因mRNA表達(dá)或其表達(dá)蛋白的檢測(cè)，目前主要有原位雜交、免疫組化、RT-PCR等方法，但仍存在特異性和敏感性方面的問(wèn)題，且一般只能粗略反映某一基因的表達(dá)水平。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)合流式細(xì)胞儀的方法近年來(lái)為國(guó)內(nèi)外研究人員所推薦

5、，但難于適應(yīng)同時(shí)進(jìn)行多通道大樣本量的臨床實(shí)踐檢測(cè)需要。 使用基因芯片可以解決上面提到的難題。基因芯片(Genechip)的檢測(cè)原理為將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列于支持物上，每平方厘米內(nèi)可排列近千個(gè)點(diǎn)。然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)，從而迅速得出所要的信息。由于基因芯片可以包含的信息非常

6、多，可以集中多達(dá)幾千種探針信息，而目前發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)基因有限，所以基因芯片能夠輕松地完成基因檢測(cè)任務(wù)。我們構(gòu)建的AML多藥耐藥基因芯片技術(shù)平臺(tái)，利用多種探針對(duì)AML多藥耐藥相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)。 首先我們建立成功了多重逆轉(zhuǎn)錄和半巢式PCR的方法檢測(cè)耐藥細(xì)胞株HL60/VCR中的多種耐藥基因表達(dá)，此方法為基因芯片的制備、條件優(yōu)化和結(jié)果驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。然后開(kāi)始了基因芯片的設(shè)計(jì)。DNA芯片的制備方法主要有兩種：一種是在直

7、接在固定面上原位化學(xué)合成一系列寡核苷酸，另一種將預(yù)先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式點(diǎn)樣，固定在固相面上。前一種有嚴(yán)格的專利保護(hù)，我們采用的是后者。本實(shí)驗(yàn)用生物學(xué)軟件Oligo6.0和primerpremier5.0，以及在線NCBIBLAST程序輔助，篩選了多種MDR基因和內(nèi)參照基因片斷的特異性探針，制備成基因芯片，通過(guò)醛基化手臂分子固定等化學(xué)處理后即可進(jìn)行雜交反應(yīng)。再?gòu)慕?jīng)建立的逆轉(zhuǎn)錄半巢式多重PCR驗(yàn)證過(guò)的耐藥細(xì)胞模型HL60

8、/VCR、臨床難治性AML患者骨髓、化療敏感的AML患者骨髓等樣本中抽提總RNA，以熒光Cy3標(biāo)記5'端的隨機(jī)六聚體引物摻入的方式，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后與芯片雜交，然后利用激光共聚集顯微掃描技術(shù)判定雜交結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)芯片制備條件和雜交反應(yīng)的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了探討和優(yōu)化。 利用基因芯片檢測(cè)多藥耐藥基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，受許多因素影響。在摸索AML多藥耐藥芯片制備和雜交條件中，我們發(fā)現(xiàn)探針的設(shè)計(jì)制備和雜交反應(yīng)是最

9、關(guān)鍵的，主要包括以下幾個(gè)方面的影響： 1.雜交序列長(zhǎng)度的影響。由于芯片檢測(cè)的機(jī)理是基于Watson-Crick配對(duì)規(guī)則，完全配對(duì)的雙鏈要比存在錯(cuò)配堿基的雙鏈分子具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，因此，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度要高5-10倍，一般來(lái)講，短的雜交序列更容易區(qū)分堿基的錯(cuò)配，但穩(wěn)定性差一些。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過(guò)程中采用加10個(gè)T臂后45個(gè)左右堿基的寡核昔酸探針，取得了較好結(jié)果。 2.雜交序列中G+C含量的影響：在基因芯片檢測(cè)中，序列組成

10、是最不確定的參數(shù)，從理論上講，富含G+C的區(qū)域雜交穩(wěn)定性較好?？紤]到在一次基因芯片檢測(cè)中將會(huì)形成幾十個(gè)，甚至成百上千個(gè)異源雜交物，所以有必要篩選出最佳的反應(yīng)條件。由于G+C含量直接決定著Tm值和雜交反應(yīng)的溫度，因此，在設(shè)計(jì)檢測(cè)探針時(shí)非常重視G+C含量，盡量做到各個(gè)探針的Tm相差在2度以內(nèi)。 3.探針濃度：探針溶在3×SSC探針緩沖液中，在設(shè)定的52℃下雜交1小時(shí)，如果探針是用手點(diǎn)的，則40pM的探針濃度雜交效果好，濃度偏高后信號(hào)

11、強(qiáng)度急劇下降甚至消失。如果探針是用點(diǎn)樣儀點(diǎn)的，則50-80pM的探針濃度雜交效果較好。 4.雜交溫度和雜交時(shí)間對(duì)雜交結(jié)果的影響：雜交溫度和雜交時(shí)間是二個(gè)比較重要的指標(biāo)，而且它們之間具有一定的聯(lián)系，一般雜交溫度高的時(shí)候，需要較短的雜交時(shí)間，而雜交溫度低的時(shí)候，雜交時(shí)間需要延長(zhǎng)。而且片段的長(zhǎng)度與雜交時(shí)間成正比，雜交片段越長(zhǎng)，所需的雜交時(shí)間也越長(zhǎng)，甚至有的需要雜交過(guò)夜，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)加深非特異性背景。我們摸索的條件是，在52℃下，進(jìn)

12、行1小時(shí)的雜交，掃描結(jié)果顯示雜交信號(hào)強(qiáng)，而且特異性也較好。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，構(gòu)建的基因芯片能同時(shí)檢測(cè)出耐藥細(xì)胞模型中多種耐藥基因表達(dá)，未見(jiàn)有非特異性的交叉反應(yīng)。對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行了初步的檢測(cè)，亦顯示了較好的特異性和敏感性。在檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn)，臨床耐藥和難治性AML患者多為多種耐藥基因聯(lián)合表達(dá)，而化療敏感患者不表達(dá)或者僅表達(dá)單一耐藥基因。至于不同組合的耐藥基因表達(dá)和臨床化療效果的關(guān)系，則需要在更大樣本量檢測(cè)時(shí)進(jìn)一步研究和統(tǒng)計(jì)確定，同時(shí)也更應(yīng)