microRNA在急性白血病的分類和預(yù)后作用及在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡中的作用機制.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：microRNA在急性白血病中的分類及預(yù)后中的作用
　　 目的：
　　 觀察23種前體miRNAs在85例初發(fā)未治急性白血病中的表達，探討miRNAs在急性白血病中分類及與預(yù)后的關(guān)系。
　　 方法：
　　 采用逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR技術(shù)檢測23種miRNAs在初發(fā)未治急性白血病患者骨髓單個核細胞中的表達，并對患者的生存期進行隨訪。
　　 結(jié)果：

2、　　 ①16個miRNAs在85例AML與ALL中差異表達，9種miRNAs在ALL中表達明顯高于AML，而7種miRNAs在AML表達明顯高于ALL。②32例ALL患者中miR-146a、miR-181a/c和miR-221與ALL患者的總生存期相關(guān)：miR-146a、miR-181a/c高表達的患者的生存期短，而miR-221高表達患者有更長的生存期。③5種miRNAs表達水平與53例AML患者生存期有顯著相關(guān)。miR-25的表達

3、水平與生存期呈正相關(guān)，另4種表達水平與生存期呈負相關(guān)。對其中的40例非M3亞型的AML病例進行分析，3種miRNAs的表達水平與生存期均呈負相關(guān)。④考慮到miR-146a是我們研究的23個miRNAs中唯一一個與AML和ALL患者總生存期相關(guān)的miRNA，追加檢測了61例初發(fā)未治AML患者骨髓標(biāo)本miR-146a，結(jié)果顯示miR-146a低表達患者生存期長。⑤通過檢索國際上5個主要的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a共有約

4、7200個可能的靶基因。
　　 結(jié)論：
　　 ①9種miRNAs在ALL中表達明顯高于AML;而7個miRNAs在AML表達明顯高于ALL。
　　 ②miR-146a、miR-181a/c高表達的ALL患者的生存期短，而miR-221高表達的ALL患者生存期長。
　　 ③miR-25的表達水平與AML患者生存期呈正相關(guān)，miR-26a、miR-29b、miR-146a、miR-196b表達水平與AML患者

5、生存期呈負相關(guān)。miR-26a、miR-29b、miR-146a的表達水平與非M3亞型的AML患者生存期均呈負相關(guān)。
　　 ④在基因本體論生物過程部分，與被預(yù)測的27901個人類可能受miRNA調(diào)控的基因相比，622個miR-146a的可能靶基因中與負性調(diào)控生物學(xué)過程、陰性調(diào)控細胞增殖、凋亡、細胞周期、細胞周期關(guān)卡、細胞周期停滯和DNA損害檢查點相關(guān)的基因比例明顯提高。miR-146a高表達的患者臨床預(yù)后相對差，可能與miR-1

6、46a高表達后抑制了靶基因表達有關(guān)。
　　 第二部分：microRNA在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡中的作用機制
　　 目的：
　　 探討microRNA在高三尖杉酯堿誘導(dǎo)急性髓系白血病細胞凋亡中表達變化，并初步探討其作用機制。
　　 方法：
　　 采用MTT比色法研究HHT對K562、HL60、U937細胞的體外生長抑制作用；采用流式細胞儀PI染色檢測細胞周期和Annexin V/PI

7、雙染色檢測細胞凋亡；采用miRNA芯片技術(shù)檢測HHT作用K562細胞后miRNA表達的變化；采用real-time PCR技術(shù)檢測HHT對K562、HL60、U937細胞成熟miRNA表達的影響；采用real-time PCR技術(shù)檢測HHT對K562、HL60、U937細胞及原代AML細胞miR-17-92表達的影響；采用real-time PCR技術(shù)檢測HHT對K562、U937細胞C-Myc和p21mRNA表達水平的影響；采用Wes

8、tern Blot技術(shù)檢測K562和U937細胞miR-17-92基因簇相關(guān)基因蛋白水平表達；采用Western Blot技術(shù)檢測HHT作用K562細胞后bcr/abl P210蛋白和Bcl-2家族蛋白水平表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 ①HHT抑制人AML細胞株K562、HL60、U937細胞的生長，均呈濃度和時間依賴性。②HHT對K562細胞無明顯的周期抑制作用，HHT能誘導(dǎo)K562、HL60、U937細胞凋亡，并呈

9、濃度依賴性。③共檢測了600多個人miRNAs表達變化，發(fā)現(xiàn)有13種miRNAs在HHT作用后3個時間點均表達下調(diào)，與對照組相比差異大于1.5倍，未發(fā)現(xiàn)3個時間點均表達上調(diào)的miRNA。進一步通過real-time PCR驗證，HHT能下調(diào)K562、HL60、U937細胞13種成熟miRNA的表達。④HHT能明顯下調(diào)K562、HL60、U937和3例原代AML細胞miR-17-92基因簇的初級轉(zhuǎn)錄本表達。⑤HHT下調(diào)K562、U937細

10、胞C-Myc mRNA表達，并上調(diào)p21mRNA表達。⑥HHT能下調(diào)K562、U937細胞P-AKT和c-Myc蛋白的表達，上調(diào)p21、PTEN、P-PTEN和E2F1蛋白的表達，而BIM和總AKT則無明顯變化。⑦HHT作用K562細胞24h后，bcr/abl P210蛋白表達才明顯下調(diào)，而促凋亡蛋白Bak、Bax表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-l表達下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 ①HHT可以抑制人AML細胞株細

11、胞的增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡。
　　 ②HHT能下調(diào)人AML細胞13種miRNA的成熟體表達，其下調(diào)miR-17-92基因簇miRNA表達是先通過下調(diào)c-Myc表達，進而下調(diào)miR-17-92基因簇的前體轉(zhuǎn)錄本表達實現(xiàn)的。HHT作用24h后才明顯下調(diào)K562細胞bcr/ablP210蛋白表達，說明HHT下調(diào)K562細胞的c-Myc表達可能并不通過bcr/abl P210融合蛋白。
　　 ③HHT上調(diào)AML細胞miR-17-92

12、基因簇及其兩個旁系同源體的共同靶基因p21、PTEN、和E2F1蛋白表達，并抑制PTEN下游AKT磷酸化，上調(diào)p21蛋白表達可能與p21mRNA表達上調(diào)有關(guān)。這些靶基因表達上調(diào)可能與HHT下調(diào)miR-17-92基因簇及其兩個旁系同源體的相關(guān)miRNAs表達有關(guān)。
　　 ④HHT還可以通過上調(diào)K562細胞的Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bak、Bax表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xl和Mcl-1表達誘導(dǎo)AML細胞凋亡。
　　 第

13、三部分 miR-17-92基因及miR-17、miR-20a的類似物和抑制劑轉(zhuǎn)染及作用機制
　　 目的：
　　 通過基因轉(zhuǎn)染進一步研究miR-17-92、miR-17、miR-20a在HHT誘導(dǎo)AML細胞凋亡中的作用機制。
　　 方法：
　　 通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將miR-17-92基因轉(zhuǎn)染進入K562和U937細胞；采用電轉(zhuǎn)法分別將miR-17和miR-20a的模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染進入K562細胞；采用We

14、stern Blot技術(shù)檢測相關(guān)靶基因表達變化；采用real-time PCR技術(shù)檢測p21基因表達變化及miRNA表達變化；采用Annexin V/PI雙染色方法檢測HHT對轉(zhuǎn)染后細胞凋亡影響。
　　 結(jié)果：
　　 ①轉(zhuǎn)染miR-17-92基因后，與對照細胞相比，K562和U937細胞的p21、E2F1和PTEN蛋白表達下調(diào)，p21mRNA表達下調(diào)。50ng/ml HHT處理轉(zhuǎn)染了miR-17-92基因的K562和U9

15、37細胞24h后，與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染后細胞早期凋亡細胞比例明顯下降。②K562細胞轉(zhuǎn)染miR-17和miR-20a的模擬物后，與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染后p21、E2F1和PTEN蛋白表達下調(diào)，p21mRNA表達下調(diào)。K562細胞轉(zhuǎn)染miR-17和miR-20a的抑制劑后，與對照細胞相比，p21、E2F1和PTEN蛋白表達上調(diào)，p21mRNA表達上調(diào)。50ng/ml HHT處理K562細胞24h后，與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染miR-17/miR-

16、20a模擬物后K562細胞早期凋亡比例明顯下降，轉(zhuǎn)染miR-17/miR-20a抑制劑后K562細胞早期凋亡比例明顯上升。
　　 結(jié)論：
　　 ①在K562和U937細胞中，p21、E2F1和PTEN是miR-17-92基因簇的靶基因。
　　 ②在K562細胞中，p21、E2F1、PTEN表達分別受miR-17和miR-20a調(diào)節(jié)，是miR-17和miR-20a的靶基因。
　　 ③結(jié)合第二部分結(jié)果，說明H

17、HT先下調(diào)了AML細胞的miR-17-92基因的表達，進而降低了miR-17和miR-20a的表達，導(dǎo)致靶基因p21、E2F1、PTEN表達上調(diào)，從而促進AML細胞凋亡。
　　 ④提高miR-17-92、miR-17、miR-20a表達均可抑制AML細胞對HHT的敏感性；抑制miR-17或miR-20a功能可促進AML細胞對HHT的敏感性。
　　 總結(jié)：
　　 HHT能誘導(dǎo)人AML細胞凋亡并下調(diào)AML細胞13種m

18、iRNAs表達。HHT下調(diào)AML細胞miR-17-92基因簇的正向轉(zhuǎn)錄因子C-Myc蛋白的表達，導(dǎo)致miR-17-92基因簇表達下調(diào)。miR-17-92基因簇表達下調(diào)導(dǎo)致miR-17、miR-20a低表達。HHT通過降低miR-17、miR-20a等miRNA表達，上調(diào)了其靶基因p21、E2F1、PTEN表達，進而誘導(dǎo)AML細胞凋亡。因而我們認為miR-17-92基因簇及其兩個旁系同源體的一些miRNAs，共同通過靶基因p21、E2F1