Notch信號(hào)通路與急性白血病發(fā)病的基礎(chǔ)和臨床研究.pdf

1、目的和意義:Notch信號(hào)通路是一個(gè)廣泛存在于生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊機(jī)制的信號(hào)通路之一，與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡有關(guān)，在胚胎發(fā)育和決定細(xì)胞命運(yùn)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中Notchl受體與腫瘤的相關(guān)性最初于人類(lèi)具有t(7；9)染色體易位的急性T淋巴細(xì)胞白血病中被發(fā)現(xiàn)，隨后越來(lái)越多研究表明惡性腫瘤的發(fā)生與異常Notch信號(hào)通路有關(guān)。 有關(guān)Notch信號(hào)通路與急性白血病發(fā)病的已有大量研究主要集中在Notch

2、受體突變與急性T淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病機(jī)理方面，在與急性B淋巴細(xì)胞白血病和急性髓性白血病的發(fā)病關(guān)系中，有Notch受體可能扮演致癌基因與抑癌基因兩種截然相反觀點(diǎn)。本研究目的：1.通過(guò)檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)分子在急性白血病中的表達(dá)，以探討Notch信號(hào)通路在急性白血病中的致病機(jī)理。2.Notch受體配基Deltal對(duì)正常細(xì)胞和白血病細(xì)胞的體外作用研究。3.Notch受體配基Deltal對(duì)白血病細(xì)胞株THP1和SHI-1的作用機(jī)理研究。通

3、過(guò)上述研究對(duì)未來(lái)急性白血病的個(gè)體化治療，有可能提供新的理論依據(jù)。 方法: 第一部分第一章采用RT-PCR方法，檢測(cè)受體Notch1和配基Jagged1以及內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β2-actin)在經(jīng)MICM診斷明確的118例初診急性白血病患者(包括T-ALL21例，B-ALL32例和AML65例)和11例同期正常供體骨髓單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平，以檢測(cè)基因=(檢測(cè)基因表達(dá)/β2-actin表達(dá))計(jì)算檢測(cè)基因的表達(dá)水平。第二、

4、三、四章建立實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，采用ABI PRISM7700 PCR儀檢測(cè)了初診T-ALL(15例)，B-ALL(16例)以及AML(18例)患者骨髓(原始+幼稚淋巴細(xì)胞>80％)和11例正常骨髓移植供者細(xì)胞中Notch1、Notch2、Jagged1、Delta1和Hes1及內(nèi)參GAPDH的表達(dá)水平，以檢測(cè)基因=(檢測(cè)基因拷貝數(shù)/GAPDH拷貝數(shù))×106計(jì)算檢測(cè)基因的表達(dá)水平。 第二部分第一章將配基Deltal蛋白和

5、對(duì)照Human IgG F(c)蛋白分別通過(guò)包被固相化在96孔板上，采用MTT法檢測(cè)，研究Deltal對(duì)正常供體骨髓CD34+細(xì)胞、臍帶血CD34+細(xì)胞、JMML患者的CD34+白血病細(xì)胞、正常人外周血CD3+細(xì)胞和CD20-CD56+細(xì)胞是否有促進(jìn)生長(zhǎng)或者抑制增殖作用。第二章采用與第一章相同的方法檢測(cè)，研究Deltal對(duì)細(xì)胞株NB4、K562、8266、THP1、SHI-1、MO7E是否有促進(jìn)生長(zhǎng)或者抑制增殖作用。 第三部分第

6、一章通過(guò)第二部分用MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Deltal對(duì)其中的兩株細(xì)胞株THP1和SHI-1有抑制生長(zhǎng)作用后，用MTT法進(jìn)一步觀察采用DAPT(信號(hào)通路中γ-分泌酶的阻斷劑)能否逆轉(zhuǎn)Deltal對(duì)THP1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)和臺(tái)盼蘭拒染法判斷THP1細(xì)胞株經(jīng)Deltal作用后的細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞存活力，并且通過(guò)瑞特染色，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，以及計(jì)算NBT還原率。用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)配基Deltal作用后THP1細(xì)胞表面抗原

7、CD13、CD14和CD11b的表達(dá)，以及用FCM檢測(cè)凋亡Annexin V的表達(dá)，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)Deltal作用THP1細(xì)胞前后靶分子Hes1的表達(dá)。第二章除了采用與第一章相同方法檢測(cè)Deltal對(duì)細(xì)胞株SHI-1作用前后的上述指標(biāo)外，還采用相同的方法檢測(cè)加入阻斷劑DAPT前后，上述相應(yīng)指標(biāo)的變化。 結(jié)果: 第一部分采用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在T-ALL、B-ALL、AML以及正常供體骨髓中均有Notch1

8、和Jagged1表達(dá)。T-ALL組與對(duì)照組比較，Notch1表達(dá)水平增高，Jagged1表達(dá)水平下降；B-ALL組與對(duì)照組比較，Notch1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，Jagged1的表達(dá)水平比對(duì)照組低；AML組與對(duì)照組比較，同樣Notch1的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，Jagged1的表達(dá)水平比對(duì)照組低。第二、第三和第四章實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)示各白血病組分別與正常對(duì)照組比較，在T-ALL中，Notch1表達(dá)增高，Jagged1表達(dá)降低；No

9、tch2、Deltal和Hes1兩組之間三個(gè)基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異；在B-ALL中，Jagged1表達(dá)降低,Deltal表達(dá)增高，其余三個(gè)基因在兩組之間的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。在AML中，Jagged1和Hes1表達(dá)降低，其余三個(gè)基因的表達(dá)水平在兩組之間沒(méi)有明顯差異。第一章中采用RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果與第二、第三章和第四章采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)方法所檢測(cè)的基因表達(dá)，其表達(dá)趨勢(shì)一致。 第二部分第一章Deltal對(duì)正常供體

10、骨髓CD34+細(xì)胞、臍帶血CD34+細(xì)胞、JMML患者的CD34+白血病細(xì)胞、正常人外周血CD3+細(xì)胞和CD20-CD56+細(xì)胞沒(méi)有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)或者抑制增殖作用。第二章 Deltal對(duì)THP1和SHI-1細(xì)胞株有抑制生長(zhǎng)作用，對(duì)NB4、K562、8266和MO7E細(xì)胞株沒(méi)有明顯的促進(jìn)生長(zhǎng)或者抑制作用。 第三部分第一章 Deltal對(duì)THP-1細(xì)胞株具有抑制生長(zhǎng)作用，而γ-分泌酶抑制劑DAPT不能逆轉(zhuǎn)Deltal對(duì)THP-1細(xì)胞

11、的生長(zhǎng)抑制作用。Deltal對(duì)THP-1細(xì)胞作用72小時(shí)后，可以明顯抑制THP-1白血病細(xì)胞株的增殖和活力。Deltal誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化，Deltal作用THP1細(xì)胞48dx時(shí)，其N(xiāo)BT還原率為(60±8)％比對(duì)照組(19±5)％升高，且與對(duì)照組比較差異有顯著性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的改變：Deltal作用于THP1細(xì)胞株72小時(shí)后，CD11b和CD14有明顯升高，提示細(xì)胞向單核系方向分化。Deltal作用72小時(shí)后，測(cè)定T

12、HP1細(xì)胞Annexin V的表達(dá)，由對(duì)照組[Human IgG F(c)]組的(10.2±5.4)％下降為(6.6±3.7)％，提示Deltal對(duì)THP1沒(méi)有凋亡作用。Deltal作用THP172小時(shí)后，靶基因Hes1的表達(dá)上調(diào)。第二章Deltal能抑制SHI-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一抑制作用能部分被DAPT抑制(逆轉(zhuǎn))。Deltal對(duì)SHI-1細(xì)胞作用72小時(shí)后，可以明顯抑制SHI-1白血病細(xì)胞株的增殖和活力。Deltal能促進(jìn)SHI-1

13、細(xì)胞凋亡。Deltal作用SHI-1細(xì)胞48小時(shí)，其N(xiāo)BT還原率為(17.6±5.2)％與對(duì)照組(15.2±4.6)％無(wú)明顯差異。Deltal對(duì)SHI-1作用后，SHI-1細(xì)胞表面CD13，CD11b和CD14的表達(dá)沒(méi)有明顯改變，加入DAPT后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組同樣沒(méi)有改變。SHI-1細(xì)胞經(jīng)過(guò)Deltal作用72小時(shí)后，Annexin V上升為(39.1±6.7)％，明顯增高，提示Deltal對(duì)SHI-1細(xì)胞有凋亡作用。加入DAPT72小時(shí)

14、后，Annexin V下降至(21.0±2.8)％，說(shuō)明DAPT有逆轉(zhuǎn)Deltal對(duì)SHI-1的凋亡作用。SHI-1經(jīng)Deltal作用72小時(shí)后，靶分子Hes1約上調(diào)10倍(134.5±23.7 vs1375.1±612.1)，加入DAPT后，Hes1又回落(1126.5±402.2 vs375.1±121.3)。 結(jié)論: (1)在T-ALL，B-ALL，AML中均存在異常Notch信號(hào)通路。 (2)T-ALL發(fā)

15、病可能與Notch信號(hào)途徑中Notch1表達(dá)增高，Jagged1表達(dá)降低有關(guān)；B-ALL發(fā)病可能與Notch信號(hào)途徑中配基Deltal表達(dá)增高，Jagged1表達(dá)降低有關(guān)；AML的發(fā)病可能與配基Jagged1降低，靶分子Hes1的表達(dá)降低有關(guān)。 (3)急性白血病中的異常Notch信號(hào)通路中，不僅與受體Notch1有關(guān)，配基Jagged1和Deltal在異常信號(hào)通路中也可能起重要作用。 (4)配基Deltal對(duì)白血病細(xì)胞株

16、THP1和SHI-1有增殖抑制作用；對(duì)細(xì)胞株NB4、MO7E、K562和8266等細(xì)胞株沒(méi)有明顯的促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)以及促進(jìn)凋亡和誘導(dǎo)分化等作用。對(duì)骨髓CD34+等細(xì)胞沒(méi)有明顯促進(jìn)生長(zhǎng)或促進(jìn)凋亡等作用。 (5)配基Deltal對(duì)THP1細(xì)胞株有抑制增殖和促進(jìn)分化作用，該作用不能被—分泌酶的抑制劑DAPT抑制(逆轉(zhuǎn))。 (6)配基Deltal對(duì)SHI-1細(xì)胞株有促進(jìn)凋亡作用，該作用能部分被γ-分泌酶的抑制劑DAPT抑制(逆轉(zhuǎn))