SCD1表達與高脂誘導肝細胞凋亡關系的研究.pdf

1、本研究分為三章： 第一章、SCD1 與高脂飲食誘導大鼠肝細胞凋亡的相關性 目的:研究SCD1 在高脂飲食大鼠肝臟的表達及其與肝細胞凋亡的相關性。 方法:30 只SD 大鼠隨機分成正常組、高脂組，分別給予普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)。在實驗的第8w，16w和24w 分批處死。HE 染色觀察肝細胞組織學改變，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法檢測SCD1 mRNA和SPT mRNA的表達，TUNEL 方法觀察肝細胞的凋

2、亡。 結果:肝組織HE 染色顯示高脂組大鼠肝臟8w 即達到脂肪肝的診斷標準。RT-PCR 分析結果顯示高脂組SCD1 mRNA 表達下降，SPT mRNA 表達進行性上升。TUNEL 凋亡檢測表明，隨著高脂喂養(yǎng)時間延長，肝細胞凋亡加重。SCD1 表達與SPT和凋亡指數(shù)（AI）呈負相關，SPT 表達和AI 指數(shù)呈正相關。 結論:長期高脂飲食可引起肝SCD1 表達下調，同時，促進細胞凋亡關鍵基因SPT的表達，肝細胞凋亡增多。

3、 第二章、SCD1 重組慢病毒載體構建 目的:構建含有大鼠肝臟SCD1基因的重組慢病毒載體pGC-FU-SCD1-GFP，為進一步研究SCD1基因在大鼠肝細胞凋亡中的作用奠定基礎。 方法:TRIZOL 法抽提大鼠肝臟總RNA，RT 得到cDNA。根據Gene-Bank中已經公布的SCD1基因序列，設計SCD1 鉤取引物，PCR 擴增SCD1 目的基因。SCD1基因克隆到慢病毒載體pGCFU質粒中。重組質粒經Age

4、1 酶切、PCR、及測序鑒定后，脂質體介導轉染293T細胞，熒光顯微鏡觀察GFP的表達及Western Blotting 檢測SCD1蛋白的表達。最后經293T細胞包裝擴增后得到攜帶SCD1基因的重組慢病毒，轉染293T細胞并對SCD1蛋白鑒定。 結果:PCR、酶切及測序鑒定證實目的基因正確克隆至慢病毒質粒pGC-FU中。293T細胞包裝出病毒顆粒的滴度為2×109TU/ml。轉染293T細胞后經熒光顯微鏡可觀察到GFP的表達，

5、Western Blotting 檢測可見SCD1蛋白的表達。 結論:過表達SCD1 重組慢病毒載體成功構建。 第三章、SCD1 過表達影響大鼠BRL 肝細胞系凋亡機理 目的:探討SCD1 過表達影響大鼠BRL 肝細胞系凋亡作用的可能途徑。 方法:通過臺盼蘭染色檢測軟脂酸誘導BRL 肝細胞死亡率確定下游實驗軟脂酸添加濃度。預試驗測定慢病毒載體在大鼠BRL 肝細胞系中表達的MOI 值。培養(yǎng)細胞分組為：非加藥

6、組和加藥組。非加藥組包括一般培養(yǎng)細胞組（CON）、一般培養(yǎng)加陰性病毒對照組（NC）及一般培養(yǎng)過表達病毒組（SCD1-LV）；加藥組包括一般培養(yǎng)加軟脂酸組（CON+）、一般培養(yǎng)加陰性病毒和軟脂酸組（NC+）及一般培養(yǎng)加過表達病毒和軟脂酸組（SCD1-LV+）。實時熒光定量PCR 檢測SCD1 mRNA，逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測SPT mRNA 表達的變化，流式細胞術測細胞線粒體膜電位的變化，用膜電位正常細胞百分比（JC-1+％）表示膜電位

7、改變，PI 單染檢測各組細胞凋亡及周期分析。 結果:與對照組相比，400μmol/L的軟脂酸誘導72h細胞死亡率顯著上升。病毒在BRL 肝細胞的復感染指數(shù)(MOI)為20。SCD1-LV組SCD1 表達明顯上升。軟脂酸誘導引起CON+和NC+組SCD1 表達的下降、SCD1-LV+組SCD1表達明顯上升；CON+和NC+組SPT 表達升高，SCD1-LV+組SPT的表達則有一定的下降；CON+和NC+組JC-1+％較低，SCD1