線粒體通透轉(zhuǎn)換孔與NAFLD肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、目的： 通過觀察PT孔在NAFLD大鼠及體外肝細(xì)胞脂肪變模型的狀態(tài)變化，研究PT孔開放與NAFLD肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系及可能的發(fā)生機(jī)制。 方法： (1)24只S-D雄性大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組(正常對照組，C組)、高脂飼料組(脂肪肝組，F(xiàn)組)，其中C組取8周時相點(diǎn)，F(xiàn)組取4周、8周、12周3個時相點(diǎn)，每時相點(diǎn)6只動物。(2)動態(tài)觀察各組：①血漿甘油三酯、游離脂肪酸、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶變化；②HE染色光鏡觀察

2、肝臟組織病理改變；③電鏡觀察肝細(xì)胞線粒體超微結(jié)構(gòu)變化；④分光光度計(jì)檢測肝細(xì)胞線粒體PT孔狀態(tài)變化；⑤流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙標(biāo)法檢測肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)；⑥免疫組織化學(xué)法及Western-blot檢測Bcl-2、Bax、Cyt C在肝臟中的表達(dá)。 (2)通過油酸誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞脂肪變建立體外NAFLD脂肪變模型(S組)，按脂變時間分為0、24、48、72小時4個時相點(diǎn)，油酸誘導(dǎo)LO2肝細(xì)胞脂肪變體外NAFLD模型加入PT孔

3、特異拮抗劑CsA組(S+CsA組)，設(shè)正常LO2肝細(xì)胞為對照組(L組)，動態(tài)觀察各組：①熒光顯微鏡法觀察PT孔的狀態(tài)變化；②流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙標(biāo)法檢測肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)；③免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測Cyt C、Bcl-2、Bax在肝細(xì)胞中的表達(dá)。 結(jié)果： (1)①在F組血漿甘油三酯、游離脂肪酸、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶隨高脂飼料飼養(yǎng)時間延長呈上升趨勢，在12周時達(dá)到高峰，差異具有顯著性(P<0.05)；②HE

4、染色結(jié)果顯示：C組大鼠肝臟無異常發(fā)現(xiàn)；F組肝臟在4周時出現(xiàn)脂肪變，病理分級為2度脂肪變，8周呈3度脂肪變，12周出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤，進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎；③電鏡下觀察F組12周肝細(xì)胞線粒體，外室及嵴內(nèi)間隙腫脹，部分內(nèi)室腫脹；④PT孔開放情況：在Ca<'++>誘導(dǎo)下，F(xiàn)組4周、8周線粒體PT孔開放比率較C組即有明顯增加，以F組12周最為顯著(P<0.05)。CsA作用下F組、C組無顯著區(qū)別(P>0.05)；⑤F組與C組相比，細(xì)胞凋亡率呈增

5、加趨勢，F(xiàn)組4周與C組相比較有所增加但無顯著差別(P>0.05)，高脂8周、高脂12周與對照組相比有顯著差別(P<0.05)；⑥免疫組織化學(xué)染色顯示： Bcl-2在C組的表達(dá)為散在弱陽性，F(xiàn)組4、8、12周陽性細(xì)胞數(shù)漸增加，并在脂肪變明顯的部位著色深；Bax在C組呈弱陽性表達(dá)，在F組隨脂肪變時間延長，表達(dá)逐漸增多，陽性細(xì)胞數(shù)增多，染色加深。Cyt C在C組肝細(xì)胞胞漿中呈黃色細(xì)顆粒，均勻分布，在F組隨著時間延長，染色加深，表達(dá)量增多，彌漫

6、分布；Western blot檢測結(jié)果顯示：F組Bcl-2、Bax、CytC蛋白的表達(dá)隨著脂肪變時間延長增多，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)尤以F組12周明顯，與C組比較，差異具有顯著性(P<0.05)；Cyt C在F組4周、8周、12周較C組明顯增加(P<0.05)，但F組間比較無顯著差異(P>0.05)。 (2)油酸與LO2肝細(xì)胞共同孵育24小時后出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變，提示NAFLD體外模型造模成功；①油酸可誘導(dǎo)S組0小時肝細(xì)胞PT

7、孔開放，PT孔開放后24小時可引起肝細(xì)胞脂肪變，PT孔的特異阻斷劑CsA可阻斷PT孔的開放。Ca<'++>作用下出現(xiàn)PT孔開放，但S組、L組比較無顯著差異(P>0.05)。②AnnexinV/PI雙標(biāo)法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率提示L組與S組24小時相比較無顯著差異(P>0.05)，S組48小時、72小時細(xì)胞凋亡率明顯增加，與L組比較有顯著差異(P<0.05)。③免疫細(xì)胞化學(xué)顯示Bcl-2、CytC在L組和S組0小時為弱陽性表達(dá)，散在棕黃

8、色顆粒存在于細(xì)胞漿，以胞核周邊為多見；Bax為弱陽性淺淡表達(dá)。隨脂肪變時間延長，Bcl-2、Bax、CytC在S組表達(dá)逐漸增高，在72小時達(dá)到高峰，Bcl-2/Bax呈逐漸升高趨勢。其中CytC、Bcl-2胞漿內(nèi)呈深棕色彌漫存在，為強(qiáng)陽性表達(dá)；與L組比較有顯著差異(P<0.05)。 結(jié)論： 1、PT孔開放介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑參與了NAFLD肝細(xì)胞凋亡。2、Bcl-2蛋白家族參與PT孔介導(dǎo)的NAFLD肝細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，升高的