線粒體損傷在NAFL大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:通過研究線粒體損傷在大鼠NAFL肝細(xì)胞凋亡中的作用,探討NAFL的發(fā)病機(jī)理.方法:(1)30只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組(正常對(duì)照組,C組)、高脂飼料組( 脂肪肝組,F組),其中每組各含4周、8周、12周3個(gè)時(shí)相點(diǎn),每時(shí)相點(diǎn)5只動(dòng)物.(2)動(dòng)態(tài)觀察各組:①體重變化;②HE染色光鏡觀察肝臟組織病理改變;③電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;④Clark氧電極檢測(cè)肝臟線粒體呼吸功能,熒光分光光度計(jì)測(cè)定線粒體膜電位;⑤硫代巴比妥酸法

2、測(cè)定肝臟組織丙二醛(MDA)的含量變化;⑥流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù);⑦免疫組織化學(xué)法及Western blot檢測(cè)Cyt C、Caspase-3、Bcl-2、Bax在肝臟中的表達(dá).結(jié)果:①體重情況: F組4周、8周、12周,體重分別為355.5±28.3g、406.2±14.5g、469.7±28.9g,而C組為244.9±16.9g、282.5±20.1g、300.7±15.8g,F組體重均高于同一時(shí)相點(diǎn)的對(duì)照組,差異具有顯著性

3、(P<0.01);②HE染色結(jié)果顯示:C組大鼠肝臟無異常發(fā)現(xiàn);F組肝臟在4周時(shí)出現(xiàn)脂肪變, 8周出現(xiàn)輕度脂肪肝,12周出現(xiàn)中、重度脂肪肝;電鏡下觀察高脂12周肝組織,肝細(xì)胞線粒體腫脹,嵴變短、減少甚至消失,并發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)濃染,邊集于核膜;③F組大鼠肝臟線粒體RCR(呼吸控制率)、P/O(磷/氧比值)比值隨飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降,高脂4、8、12周RCR分別為:4. 84±0.18、3.87±0.44、3.51±0.18,C組4、8、12周

4、RCR分別是:4.74±0.38、4.93±0.79、4.85±0.47,F組4周與C組4周無顯著差異,而F組8、12周與相應(yīng)時(shí)相C組比較,RCR顯著降低(P<0.05或P<0.01), F組4、8、12周P/O比值3.61±0.39、3.56±0.34、3.37±0.25較C組相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)(4.22±0.63、4.11±0.29、4.13±0.39)均降低,具有顯著性意義(P<0.05或P<0.01); ④C組4、8、12周線粒體膜電位

5、相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為951.2±64.6、977.2±78.3、958.6±70.4,組間無明顯差異,而高脂4、8、12周線粒體膜電位相對(duì)熒光強(qiáng)度分別833.1±53.5、772.2±73.4、587.2±63.1,呈逐漸下降趨勢(shì),與相應(yīng)時(shí)相C組比較明顯降低,差異顯著(P<0.05或P<0.01);⑤第4周后肝臟內(nèi)MDA含量在F組明顯高于對(duì)照組(P<0.05),隨時(shí)間延長(zhǎng),F組MDA逐漸增加;⑥F組4周肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)(4.2±0.4)與

6、C組肝細(xì)胞(4.1±0.3)無明顯差異,但F組8周、12周肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯增加,分別為9.2±0.4、11.6±1.1,C組8、12周分別為4.3±0.3、4.3±0.2,具有顯著差異(P<0.01);⑦免疫組織化學(xué)染色顯示:Cyt C在C組肝細(xì)胞胞漿中呈黃色細(xì)顆粒,均勻分布,在F組隨著時(shí)間延長(zhǎng),染色加深,呈片狀分布,范圍擴(kuò)大.Caspase-3在C組肝臟中呈散在分布,胞漿內(nèi)著色,弱陽性,F組4周散在分布,著色較正常加深,F組8、1

7、2周著色逐漸加深,陽性細(xì)胞數(shù)增加,呈現(xiàn)彌漫陽性;Bcl-2、Bax在C組的表達(dá)均為散在弱陽性,F組4、8、12周陽性細(xì)胞數(shù)漸增加,并在脂肪變明顯的部位著色深;⑧Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:F組Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)增高,尤以F組8周及12周增加明顯,與C組比較,差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01);隨著脂肪肝的進(jìn)展,Bcl-2 / Bax比率逐漸下降,Cyt C在F組4周、8周、1

8、2周較C組明顯增加(P<0.05),但F組間比較無明顯差異.結(jié)論:1、NAFL大鼠肝細(xì)胞凋亡在NAFL的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用,脂肪變?cè)街亍⒀装Y越明顯的肝組織,肝細(xì)胞凋亡越多;2、肝臟線粒體功能損傷在NAFL發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用,肝臟脂肪變程度越重,其線粒體功能損傷越明顯,并在單純性脂肪肝向脂肪性肝炎進(jìn)展的過程中起重要作用;3、線粒體呼吸功能損傷后引起的脂質(zhì)過氧化、氧應(yīng)激,引發(fā)了線粒體膜電位下降,啟動(dòng)了Cyt C由線粒體向胞漿內(nèi)釋放,