Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與線粒體能量代謝障礙的關(guān)系研究.pdf

1、目的：在體外試驗(yàn)系統(tǒng),初步探討Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與線粒體能量代謝障礙的關(guān)系,為進(jìn)一步闡明Cr(Ⅵ)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供線索。
　　 方法：以L-02肝細(xì)胞為受試細(xì)胞,通過MTT試驗(yàn)檢測不同濃度單獨(dú)Cr(Ⅵ)及單獨(dú)ATP染毒對L-02肝細(xì)胞存活率的影響,篩選確定低、中、高Cr(Ⅵ)作用濃度及ATP有效干預(yù)濃度即Cr(Ⅵ)處理濃度為2.5μmol/L,10μmol/L,40μmol/L及ATP濃度為1μmol/L,染毒時間

2、為24h。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及DNA-Ladder檢測細(xì)胞凋亡,反相高效液相色譜檢測細(xì)胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量變化,氧電極檢測細(xì)胞線粒體呼吸功能(ST3、ST4、RCR、P/O),熒光分光光度法檢測線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(PTP)及跨膜電位(△ψm)、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS),酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性。
　　 結(jié)果：⑴Cr(Ⅵ)引起L-02肝細(xì)胞存活率降低:Cr(Ⅵ)在2.5-100μmaol/L處理濃

3、度范圍內(nèi),能明顯引起L-02肝細(xì)胞存活率的降低(P＜0.05),處理濃度和細(xì)胞存活率之間存在負(fù)相關(guān)(r=-0.909,P=0.00)選取2.5μmol/L、10μmol/L和40μmol/L Cr(Ⅵ)濃度和細(xì)胞生存率最高的ATP濃度1μmol/L。⑵Cr(Ⅵ)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡:與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理組細(xì)胞凋亡率均明顯上升,加入ATP可明顯減輕中劑量組細(xì)胞凋亡率,而在高劑量組引起細(xì)胞凋亡率上升,壞死率下降(P＜0.05)。⑶Cr(Ⅵ

4、)引起肝細(xì)胞DNA損傷:中、高劑量Cr(Ⅵ)處理組誘導(dǎo)細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂,加入ATP聯(lián)合處理組,細(xì)胞DNA斷裂均明顯減輕。⑷Cr(Ⅵ)對肝細(xì)胞caspase-3表達(dá)的影響:與對照組相比,其他各組caspase-3活性均明顯升高(P＜0.05)。ATP加入高劑量Cr(Ⅵ)處理組caspase-3活性明顯降低(P＜0.05)。⑸Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞氧化應(yīng)激:與對照組相比,除了ATP處理組外,其他各組ROS水平均有所升高(P＜0.05)。⑹C

5、r(Ⅵ)所致細(xì)胞線粒體損傷:與對照組相比,各處理組線粒體PTP孔開放度和線粒體膜電位(△ψm)下降均有所增加(P＜0.05)。加入ATP聯(lián)合處理,中劑量、高劑量組與相同濃度的Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理組相比,PTP孔開放度降低,膜電位下降率降低(P＜0.05)。⑺Cr(Ⅵ)對細(xì)胞ATP、ADP、AMP的影響:與對照組相比,低劑量Cr(Ⅵ)組中ATP、ADP、TAN略有上升,中、高劑量Cr(Ⅵ)處理組則明顯降低(P＜0.05),加入ATP的各處理

6、組,以上各指標(biāo)均與相應(yīng)濃度的Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理組有差別(P＜0.05)。與對照組相比,細(xì)胞能荷(Ec)在中劑量Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理組上升,高劑量Cr(Ⅵ)單獨(dú)處理組下降(P＜0.05)。⑻Cr(Ⅵ)和ATP對肝細(xì)胞細(xì)胞呼吸功能影響:與對照組相比,各Cr(Ⅵ)處理組RCR明顯降低,40μmol/L Cr(Ⅵ)+ATP與相同濃度的Cr(Ⅵ)處理組相比明顯升高(P＜0.05)。與對照組相比,Cr(Ⅵ)處理組P/O均明顯降低(P＜0.05)。