牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離鑒定及過表達(dá)SCD1基因的研究.pdf

1、脂肪組織是機體中重要的能量存儲與內(nèi)分泌器官，參與調(diào)節(jié)機體的脂肪酸代謝、糖代謝、膽固醇代謝等生理過程。成體脂肪組織中存在的具有多能性的細(xì)胞稱為脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)不僅是研究脂肪細(xì)胞分化過程的理想模型，也是研究能量代謝與信號通路的重要模型。脂肪組織中脂肪酸的組成對于家畜肉產(chǎn)品的風(fēng)味與口感有著非常大的影響，單不飽和脂肪酸(monounsaturated f

2、atty acids，MUFA)的含量是其中一個決定因素。動物組織中催化合成MUFA的限速酶稱為硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturasel，SCD1）。SCD1不僅參與調(diào)控機體的脂肪酸代謝與能量平衡，對家畜肉產(chǎn)品質(zhì)量也有直接的影響。本研究分離鑒定了牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的模型，研究SCD1基因過表達(dá)對脂肪酸代謝相關(guān)基因及脂肪酸組成的影響，探討利用基因修飾提高牛脂肪組織中單

3、不飽和脂肪酸濃度的方法。
　　1.牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
　　本研究從牛的皮下脂肪中分離得到細(xì)胞，隨后對其生長曲線、染色體數(shù)目、細(xì)胞克隆形成能力等生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測，并利用免疫熒光技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)、體外誘導(dǎo)分化技術(shù)對獲得的細(xì)胞的分子標(biāo)記和分化潛能等特性進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，本研究所獲得細(xì)胞能夠在體外快速增殖、細(xì)胞克隆形成能力較強，體外連續(xù)培養(yǎng)過程中生物學(xué)特性保持良好，染色體數(shù)穩(wěn)定，可連續(xù)培養(yǎng)至55代;檢測第5

4、代細(xì)胞的表面分子標(biāo)記，表達(dá)CD13、CD44、CD49d、CD90、CD105、Vimentin，不表達(dá)CD34分子，其中CD44與CD90的陽性率分別為92.24±2.12％、15.33±1.49％，傳代后陽性細(xì)胞的比例逐漸下降;第5代細(xì)胞在成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天后，針對脂肪、骨、軟骨的特異性染色結(jié)果均呈陽性，特異性標(biāo)記基因的表達(dá)經(jīng)RT-PCR鑒定也呈陽性。上述結(jié)果表明，本實驗成功分離培養(yǎng)了牛脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞系(bA

5、DSCs)。
　　隨后，本研究通過Realtime PCR檢測bADSCs向脂肪方向分化過程中脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果顯示:包括SCD1基因在內(nèi)的脂肪酸合成相關(guān)基因的mRNA水平表現(xiàn)為誘導(dǎo)7天后顯著上升，之后開始下降（P＜0.05）;脂肪酸沉積相關(guān)基因則表現(xiàn)為誘導(dǎo)后基因轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)升高至第14天后開始下降;脂肪酸氧化分解相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄高峰期則各不相同（P＜0.05）。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析bADSCs向脂肪方向分化過程中脂

6、肪酸組成的檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)7天后棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)和MUFA、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的含量以及去飽和指數(shù)（C16∶1/C16∶0和C18∶1/C18∶0）均顯著上升（P＜0.05），之后有所回落。而棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)誘導(dǎo)7天后顯著下降（P＜0.05），第14天到21天

7、又有所回升(P＞0.05)。表明bADSCs成脂誘導(dǎo)后的第7～14天是脂肪酸合成比較活躍的階段，其中第7天是不飽和脂肪酸合成的高峰期，SCD1對細(xì)胞中的脂肪酸合成具有重要的影響。
　　2.SCD1基因過表達(dá)對牛胎兒成纖維細(xì)胞與脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中脂肪酸代謝相關(guān)基因和脂肪酸組成的影響
　　本研究首先通過EcoT22I酶切將脂肪特異性啟動子小鼠FABP4基因5.9kb的全長啟動子片段精簡為2.3kb，分別將5.9kb和2.3kb的

8、片段與pDs-Red2-1載體連接后，分別轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞(bEFs)與bADSCs，通過對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行Realtime PCR檢測，表明2.3kb比5.9kb片段的啟動效率提高了一倍。
　　構(gòu)建小鼠FABP4基因啟動子（2.3kb片段）驅(qū)動SCD1基因表達(dá)的質(zhì)粒pFS，轉(zhuǎn)染bADSCs后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染效率，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件。然后將pFS質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染bEFs和bADSCs，通過G418篩選獲得穩(wěn)

9、定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆經(jīng)PCR鑒定及Realtime PCR檢測整合拷貝數(shù)。結(jié)果得到一株bEFs轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，載體的整合拷貝數(shù)為0.99±0.05，得到3株bADSCs轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆，1＃、2#、3#克隆的整合拷貝數(shù)分別為2.00±0.23、6.07±0.37、3.94±0.29。對轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后的細(xì)胞及篩選后的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆中脂肪酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行Realtime PCR檢測，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析脂肪酸組成的變化，

10、結(jié)果如下:
　　1)轉(zhuǎn)染bEFs細(xì)胞系后，SCD1和促進(jìn)脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄因子膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein-1，SREBP1）的mRNA水平24h顯著升高然后回落(P＜0.05)，脂肪酸氧化降解基因則始終顯著高于對照(P＜0.05)，其余檢測基因多數(shù)表現(xiàn)為先升高后降低的模式。轉(zhuǎn)染bADSCs細(xì)胞系后，SCD1和促進(jìn)細(xì)胞向脂肪方向分化的轉(zhuǎn)錄因子過氧化物

11、酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARg)與脂肪細(xì)胞標(biāo)記基因脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid-binding protein，F(xiàn)ABP4）的轉(zhuǎn)錄水平不斷升高(P＜0.05)，脂肪酸氧化降解基因也高于對照(P＜0.05)，其余檢測基因無顯著變化。
　　2)bEFs轉(zhuǎn)基因1#細(xì)胞克隆中SCD1基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05），其他基因或者顯著

12、下降或者無變化，C16∶0、C18∶0、SFA顯著升高（P＜0.05），C16∶1、C18∶1、去飽和指數(shù)、MUFA無差異（P＞0.05），PUFA顯著降低（P＜0.05）。
　　bADSCs轉(zhuǎn)基因克隆1#的SCD1和其他脂肪酸代謝基因表達(dá)均低于對照組但PPARg顯著升高（P＜0.05），C16∶0、C16∶1、C18∶0、C16∶1/C16∶0均與對照相接近，C18∶1、C18∶1/C18∶0則顯著低于對照，細(xì)胞中的SFA含量最

13、高，MUFA含量最低，PUFA水平居中。轉(zhuǎn)基因克隆2#的SCD1基因表達(dá)顯著升高，同時脂肪酸代謝基因轉(zhuǎn)錄水平上升，C16∶0和C18∶0顯著低于其他組，C16∶1、去飽和指數(shù)、MUFA和PUFA相對最高，SFA含量最低。轉(zhuǎn)基因克隆3#的SCD1和其他脂肪酸代謝系列基因均低于對照，C16∶0、C18∶0、去飽和指數(shù)與對照無顯著性差異，C16∶1顯著高于對照、C18∶1顯著低于對照，細(xì)胞中的SFA、MUFA和PUFA均與最高值無顯著性差異。

14、表明非脂肪細(xì)胞和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞中的SCD1基因表達(dá)模式不同，同時脂肪酸組成也相應(yīng)有所不同。
　　3)進(jìn)一步對bADSCs轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆成脂誘導(dǎo)分化過程中的脂肪酸代謝相關(guān)基因和脂肪酸組成的情況進(jìn)行檢測，得到如下結(jié)果:誘導(dǎo)第7天時，所有細(xì)胞克隆SCD1與多數(shù)脂肪酸相關(guān)基因的表達(dá)低于對照或無顯著性差異，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆中除了克隆1#的C16∶1、C18∶1、去飽和指數(shù)、MUFA均為最高外，另外兩組與對照組無顯著性差異。誘導(dǎo)第14天時，S

15、CD1基因的表達(dá)情況是克隆2#最，克隆3#居中，克隆1#和對照最低(P＜0.05)，所有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆的C16∶1和MUFA均顯著高于對照組，SFA則低于對照（P＜0.05）。表明，3個bADSCs轉(zhuǎn)基因克隆在成脂誘導(dǎo)前SCD1基因表達(dá)有所不同，但誘導(dǎo)后SCD1基因均高表達(dá)，同時MUFA含量得到提升，初步證明脂肪特異性過表達(dá)SCD1可以提高脂肪細(xì)胞內(nèi)的MUFA。
　　綜上所述，本研究從牛的皮下脂肪中成功分離獲得了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，

16、對其生物學(xué)特性等進(jìn)行了檢測，最終鑒定該細(xì)胞符合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。外源SCD1的轉(zhuǎn)入可以瞬時提高細(xì)胞內(nèi)脂肪酸合成基因的表達(dá)，但穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的bEFs和bADSCs中，SCD1基因表達(dá)有所差異。但是bADSC轉(zhuǎn)基因克隆細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，SCD1基因表達(dá)上升，其產(chǎn)物(C16∶1、C18∶1)、去飽和指數(shù)及MUFA均顯著升高。因此，通過轉(zhuǎn)入脂肪特異性啟動子驅(qū)動的SCD1基因可以特異性的提高脂肪細(xì)胞中MUFA的含量，其表達(dá)特性及分子調(diào)控則有待