人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定及抑制異基因淋巴細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 1、體外分離培養(yǎng)、純化并鑒定人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hAMSCs)。 2、研究hAMSCs對異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MIR)體系中淋巴細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞因子的影響。 研究方法： 1、采用酶消化法從羊膜分離出hAMSCs，進(jìn)行傳代培養(yǎng)、逐步純化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志，并通過條件培養(yǎng)基定向誘導(dǎo)，最后根據(jù)形態(tài)學(xué)、生物學(xué)特征、細(xì)胞表面標(biāo)志以及分化潛能鑒定hAMSCs純度。 2、建立雙向MLR

2、體系，加入絲裂霉素處理過的不同比例的hAMSCs，用3H摻入法測定淋巴細(xì)胞增殖率并用ELISA法測定混合培養(yǎng)上清液中自細(xì)胞介素-2(IL-2)和干擾素-γ(IFN-γ)的含量，觀察hAMSCs對淋巴細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子的影響。研究結(jié)果： 1、從羊膜中分離的細(xì)胞接種24小時(shí)后便有少量的細(xì)胞貼壁，經(jīng)1周后逐漸形成扁平單層細(xì)胞，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細(xì)胞密度的增加，胞體變得細(xì)長，形態(tài)類似成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞可以穩(wěn)定生長傳代，

3、而且體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢。 2、hAMSCs的原代細(xì)胞在接種后2～8天后進(jìn)入對數(shù)生長期，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞突起向周圍伸展，出現(xiàn)兩個(gè)核細(xì)胞分裂相的hAMSCs多見，細(xì)胞密度增大，彼此相連；11～14天進(jìn)入平臺期，hAMSCs鋪滿瓶底，細(xì)胞擴(kuò)增趨緩，原代培養(yǎng)結(jié)束。hAMSCs傳代后P3代和P15代的生長曲線顯示，隨著hAMSCs的逐漸純化，細(xì)胞倍增速度基本穩(wěn)定。傳代后6～12小時(shí)，相差顯微鏡下即可觀察到細(xì)胞

4、貼壁；2～4天后進(jìn)入到對數(shù)生長期，擴(kuò)增速度明顯快于原代培養(yǎng)；6～7天即可鋪滿培養(yǎng)板底。 3、hAMSCs表達(dá)有BMSCs相似的表面標(biāo)志，流式細(xì)胞儀檢測顯示，hAMSCs表達(dá)CD29、CD44和CD105，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR和CD106。 4、hAMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)24h后，細(xì)胞形態(tài)明顯改變，胞體回縮，胞核部分折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)類似于樹突及軸突樣結(jié)構(gòu)，染色可見兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和兔抗

5、人膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)陽性。hAMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化2周后，細(xì)胞形態(tài)由紡錘形轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，染色可見I型膠原陽性；3～4周后可見鈣結(jié)節(jié)形成。 5、用3H-TdR摻入法對淋巴細(xì)胞增殖進(jìn)行檢測。hAMSCs以不同的hAMSCs/外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)比例加入MLR體系共同培養(yǎng)后，各組cpm值均較培養(yǎng)前明顯下降(P均＜0.05)；hAMSCs/PBMC比例為1∶5和1∶10的兩組，其增殖抑制率均明顯強(qiáng)于1∶500組(

6、P均＜0.05)。 6、hAMSCs與未經(jīng)活化的淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)(PBMC1+hAMSCs組、PBMC2+hAMSCs組)時(shí)，培養(yǎng)上清中的IL-2、IFN-γ水平與單獨(dú)淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(PBMC1組或PBMC2組)上清中的水平無明顯變化(P均＞0.05);hAMSCs加入MLR體系(PBMC1+PBMC2+hAMSCs組)中培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌均明顯低于單純MLR體系(PBMC1+PBMC2組)中的量(P＜0.

7、05)。 研究結(jié)論： 1、體外可以分離培養(yǎng)hAMSCs，hAMSCs具有與BMSCs相似的細(xì)胞生物學(xué)特性以及多向分化潛能。 2、hAMSCs可以抑制MLR體系中淋巴細(xì)胞的增殖，呈劑量依賴性；并可下調(diào)MLR體系中IL-2和IFN-γ水平，對同種異體免疫反應(yīng)具有負(fù)調(diào)節(jié)作用，為日后臨床聯(lián)合應(yīng)用MSCs和造血干細(xì)胞移植以預(yù)防和治療移植物抗宿主病(GVHD)提供理論基礎(chǔ)。 3、hAMSCs可以作為間充質(zhì)干細(xì)胞(MS