大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響.pdf

1、近年來的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有可塑性，在特定的條件下可分化為各胚層來源的組織細(xì)胞，稱為橫向分化(transdifferentiation)，這一發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)理論的發(fā)展有重大意義，對(duì)于各種因素導(dǎo)致的組織和器官病變以及遺傳缺陷性疾病的細(xì)胞替代治療也具有深遠(yuǎn)的影響。由于骨髓MSCs易于分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，可自體移植無免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，因此利用骨髓MSCs橫向分化潛能，可以根據(jù)需要將其誘導(dǎo)分化為特定的組織細(xì)胞，用以修復(fù)受損的

2、組織或器官，這也將為免疫功能紊亂的治療提供了另一條途徑。 在骨髓MSCs應(yīng)用過程中，它與血管內(nèi)皮細(xì)胞或組織細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)(extraccllularmatrix，ECM)的粘附是發(fā)揮修復(fù)治療作用的第一步。研究證明，粘附分子在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)問粘附過程中起著重要的作用。因此，探討骨髓MSCs的黏附分子的生物學(xué)及分子學(xué)基礎(chǔ)就顯得尤為重要。 近年來愈來愈多的研究還顯示了MSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性，使其在免疫抑制方面

3、具有可預(yù)期的理論意義和使用價(jià)值。 就此，本課題第一部分系統(tǒng)研究了骨髓MSCs的分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)增及黏附分子測(cè)定，第二部分重點(diǎn)研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。 試驗(yàn)一：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及黏附分子測(cè)定 目的：探討體外分離培養(yǎng)和擴(kuò)增大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的最佳條件，并對(duì)其進(jìn)行表型鑒定及黏附分子測(cè)定。 方法：采用全骨髓直接貼壁法獲得原代大鼠骨髓MSCs，差速貼壁結(jié)合消化控制法

4、純化細(xì)胞，Ⅰ型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)增MSCs；鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第4代MSCs的細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行表型鑒定與細(xì)胞黏附分子檢測(cè)。 結(jié)果：原代培養(yǎng)的MSCs呈圓形、梭形、多角形等，24h內(nèi)即可見少量細(xì)胞體壁伸展，7～8d左右可達(dá)90％融合，純化擴(kuò)增后的MSCs呈均勻一致的長(zhǎng)梭形，24h內(nèi)細(xì)胞已基本貼壁，傳代周期為5d左右。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，第4代MSCs約有80％處于G0/G1期。免疫

5、細(xì)胞化學(xué)顯示，MSCsCD34、CD45表達(dá)陰性，CD29、CD105、CD166、VLA-4、P-selectin表達(dá)陽性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)方法能很容易地獲得大量高純度的MSCs，并表達(dá)一定的黏附分子，為MSCs進(jìn)一步臨床應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。 試驗(yàn)二：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響 目的：探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。 方法：采用試驗(yàn)一的方法分離獲得MSCs，尼龍棉柱法