人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)機(jī)制的研究.pdf

1、目的：動(dòng)態(tài)觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)對(duì)異體T細(xì)胞內(nèi)因子IL2、IFN<,-γ>、IL-4、IL-10的影響，從而探討其抑制T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)、進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，為其用于自身免疫性疾病治療及降低移植物抗宿主病(glaft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生率等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料和方法：采用Ficoll密度梯度分離和體外貼壁、傳代培養(yǎng)，從人骨髓中分離、擴(kuò)增出

2、MSCs，通過其形態(tài)的均一性及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志加以鑒定其純度；通過Ficoll分離法和尼龍棉柱法獲取外周血T淋巴細(xì)胞，以經(jīng)絲裂霉素(mitomycin-C，MMC)處理后的1×10<'5>/孔 MSCs作為基底層細(xì)胞，接種體外分離純化的異體T淋巴細(xì)胞，分別于12h、24h、48h、72h、96h、5天后收集T淋巴細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR(FQ-PCR)，測(cè)定T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2、IFN<,-γ>、IL

3、-10的mRNA表達(dá)量，動(dòng)態(tài)觀察四種因子的變化趨勢(shì)，以確定下一步實(shí)驗(yàn)選擇的時(shí)間點(diǎn)。繼而將MSCs分別調(diào)整至以1×10<'3>、1×10<'4>、1×10<'5>個(gè)細(xì)胞/孔作為不同細(xì)胞含量組，接種子培養(yǎng)板，然后加入PHA刺激的外周血T淋巴細(xì)胞1×10<'6>孔 A組和含外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)與T淋巴細(xì)胞均1×10<'6>/孔的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)培養(yǎng)體系B組，培養(yǎng)72h，F(xiàn)Q-PCR檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2、IFN<,-γ>、

4、IL-4、IL-10在mRNA水平上的變化；以25﹪、50﹪和75﹪濃度的MSCs培養(yǎng)上清分別加入到PHA刺激的異體T淋巴細(xì)胞C組，共培養(yǎng)72h后，同樣FQ-PCR檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)IL-2、IFN<,-γ>、IL-4、IL-10細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，2～4天可見成纖維樣貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，增殖速度較慢；7～10天克隆中的細(xì)胞增殖較快，呈旋渦狀或平行排列，形態(tài)均一；約2周左右，細(xì)胞融合成單層，排列有方向性。傳代

5、細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)特征，生長(zhǎng)迅速，6～8天即達(dá)完全融合。對(duì)MSCs傳代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定亦顯示，3～6天是細(xì)胞快速增殖期，7天后速度減慢進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人骨髓MSCs表面抗原，其高表達(dá)CD166、CD105、CD29、CD13，低表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR；3代以后的MSCs純度達(dá)到95﹪以上。對(duì)一定數(shù)量的骨髓MSCs加入MLC體系中共培養(yǎng)，動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，在72h時(shí)，IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10 m

6、RNA含量基本達(dá)到穩(wěn)定：MSCs促進(jìn)IL-2、IL-4和IL-10表達(dá)(P<0.05)，抑制IFN-γ(P<0.05)。在A組，與未加MSCs的對(duì)照相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs和PHA作用下的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，MSCs明顯抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2和IFN-γ的表達(dá)(P<0.05)，而促進(jìn)IL-4和IL-10的表達(dá)(P<0.05)，且都呈數(shù)量依賴性(P<0.05)。在B組，與未加骨髓MSCs的對(duì)照相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs加入M

7、IC體系中共培養(yǎng)72h后，MSCs抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IFN-γ(P<0.05)，增加IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)(P<0.05)；MSCs對(duì)IFN-γ和IL-10的影響呈數(shù)量依賴性(P<0.05)，但對(duì)IL-2和IL-4的影響在本組中未顯著呈現(xiàn)出MSCs數(shù)量依賴性(P>0.05)。在C組，與未加骨髓MSCs培養(yǎng)上清的對(duì)照相比，在不同濃度的骨髓MSCs培養(yǎng)上清液和PHA作用72h后，培養(yǎng)上清可以抑制T細(xì)胞內(nèi)因子IL-2和IFN-γ表

8、達(dá)(P<0.05)，且抑制呈濃度依賴性(P<0.05)：上清液促進(jìn)IL-4表達(dá)(P<0.05)，亦呈濃度依賴性(P<0.05)，而對(duì)IL-10影響無顯著性(P>0.05)。 結(jié)論：①骨髓MSCs可能通過細(xì)胞與細(xì)胞之間的直接接觸以及分泌可溶性因子調(diào)節(jié)Th1/Th2反應(yīng)平衡，抑制Th1細(xì)胞亞群的功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。②T細(xì)胞在不同的刺激原作用下，MSCs對(duì)其作用的機(jī)制可能不同：在PHA作用下，MSCs主要通過抑制Th1細(xì)胞亞群、增