骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在淋巴細(xì)胞參與下影響HBV復(fù)制的體外研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BM MSCs）在體外淋巴細(xì)胞參與下對(duì)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）復(fù)制的影響及其機(jī)制的初步研究。
　　方法：⑴選用體重80-100gBN大鼠，應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)/貼壁分離篩選法，分離、培養(yǎng)并擴(kuò)增BM MSCs，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)所培養(yǎng)的第3代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記分子鑒定，并通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為脂肪、成骨細(xì)胞，檢測(cè)BM

2、MSCs的分化能力。⑵細(xì)胞共培養(yǎng)：選取狀態(tài)良好的第三代BM MSCs，提取BN大鼠新鮮的脾淋巴細(xì)胞，選擇培養(yǎng)狀態(tài)良好的HepG2.2.15細(xì)胞，采用Transwell小室做細(xì)胞共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：共5組，第1組為單純脾淋巴細(xì)胞組；第2組為單純HepG2.2.15細(xì)胞組；第3組為BM MSCs+Hep G2.2.15細(xì)胞組；第4組為脾淋巴細(xì)胞+HepG2.2.15細(xì)胞組；第5組為脾淋巴細(xì)胞+BM MSCs+HepG2.2.15細(xì)胞組。⑶在共

3、培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，采用MTT法對(duì)脾淋巴細(xì)胞及貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定上清液中HBV DNA水平、HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA水平及BM MSCs中的HBVcccDNA水平，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群的比例變化進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-10水平。
　　結(jié)果：①BM MSCs鑒定：在體外成功提取并擴(kuò)增BM MSCs，對(duì)所提取的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，其

4、具備典型的 MSCs的形態(tài)特點(diǎn)，培養(yǎng)到第3代細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記分子學(xué)鑒定，結(jié)果顯示：CD29、CD90、RT1A表達(dá)的陽(yáng)性率分別為97.0％、96.3%和96.3%，而CD34、CD45、RT1B陰性率均>95％，且經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)分化后，所提細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)能夠成功分化為成骨細(xì)胞（經(jīng)由von kossa染色后在顯微鏡下可以觀察到黑色鈣鹽沉積）及脂肪細(xì)胞（經(jīng)由油紅 O染色后顯微鏡下可觀察到細(xì)胞胞漿內(nèi)呈紅色脂滴）。②檢測(cè)BM MSCs對(duì)HBV復(fù)制的

5、影響：在體外細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境下HBV DNA及HBV cccDNA在24h、48h及72h時(shí)，與第2、3和4組比較，第5組HBV DNA的表達(dá)水平明顯降低，且在48h時(shí)差異顯著， HBV DNA：（181.000±14.731）IU/mLvs（6270.000±300.450）IU/mL、（2564.000±231.058）IU/mL、（2433.300±302.379）IU/mL；HBV cccDNA：（4.330×105±0.464×

6、105）IU/mL vs（11.100×105±0.375×105）IU/mL、（8.930×105±0.778×105） IU/mL、（9.850×105±0.810×105）IU/mL，P<0.01；各組BM MSCs中均未檢測(cè)出HBV cccDNA的復(fù)制。③BM MSCs對(duì)HBV復(fù)制影響機(jī)制：細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果，上清中淋巴細(xì)胞及BM MSCs分泌IFN-γ的水平與HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)（淋巴細(xì)胞24 h：r=-0.900；48

7、h：r=-0.982；72 h：r=-0.968，P<0.05。BM MSCs24h：r=-0.828；48h：r=-0.922；72h，r=-0.828，P<0.05），而IL-10水平與HBV DNA水平呈正相關(guān)（24h：r=0.860，48h：r=0.972，P<0.05）。T細(xì)胞亞群檢測(cè)，結(jié)果顯示CD4+/CD8+比例有所升高，且經(jīng)相關(guān)性分析，共培養(yǎng)后淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD8+細(xì)胞的百分率與HBV DNA水平呈正相關(guān)（24h：r=