HIF-2α—SCD1通路在低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為中作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)最常見的、也是發(fā)病率和死亡率最高的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們的健康。因此，探索肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的發(fā)生機(jī)制，為HCC尋求有效的治療途徑十分必要。
　　大多數(shù)癌細(xì)胞內(nèi)存在著相對(duì)低氧的微環(huán)境。低氧誘導(dǎo)因子-2α（Hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α）是細(xì)胞氧信號(hào)途徑中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，與惡性腫瘤的

2、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)。HIF-2α在腎癌、肝癌等腫瘤中高表達(dá)，它能通過(guò)啟動(dòng)其下游靶基因，而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲力增強(qiáng)，加速疾病惡化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下HIF-2α通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)分化相關(guān)蛋白表達(dá)，導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞株LO2細(xì)胞發(fā)生脂肪變性。然而，有關(guān)HIF-2α能否通過(guò)調(diào)控肝癌細(xì)胞脂質(zhì)代謝進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究，目前尚無(wú)報(bào)道。
　　癌細(xì)胞的低氧環(huán)境加劇細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成。硬脂酰輔酶A去和酶1（Stearoyl-C

3、oA desaturase-1,SCD1）是催化多元不飽和脂肪酸（Monounsaturated fatty acid，MUFA）合成的關(guān)鍵酶。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SCD1在肝癌中高表達(dá)，它可通過(guò)抑制腺苷酸活化蛋白激酶（ AMP-activated protein kinase，AMPK）負(fù)性調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡、促生存，而影響肝癌的形成及發(fā)展。但是，SCD1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)升高的機(jī)制尚不清，低氧環(huán)境下是否通過(guò)HIF-2α介導(dǎo)其

4、表達(dá)，未見相關(guān)研究報(bào)道。
　　鑒于此，本研究首先觀察低氧環(huán)境下HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞株HIF-2ɑ、SCD1表達(dá)水平；在此基礎(chǔ)上，使用HIF-2α下調(diào)質(zhì)粒及SCD1小分子抑制劑CAY10566，探討HIF-2α是否通過(guò)調(diào)控SCD1表達(dá)，而影響肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為，為HCC的發(fā)病機(jī)制提供新證據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　一、低氧誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關(guān)系：
　　1.細(xì)胞培

5、養(yǎng)：用含10％胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液分別培養(yǎng)SMMC-7721和HepG2細(xì)胞。
　　2.低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HIF-2α和SCD1蛋白表達(dá)時(shí)間譜：1% O2刺激HepG2和SMMC-7721細(xì)胞0、3、6、12、24h，收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞并提取總蛋白，用Western blot（WB）法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肝癌細(xì)胞HIF-2α及SCD1蛋白表達(dá)水平。
　　3.篩選shRNA-HIF-2α質(zhì)粒

6、：設(shè)置空白、陰性質(zhì)粒、shRNA-HIF-2αA-D質(zhì)粒，按照shRNA-HIF-2α質(zhì)粒的使用說(shuō)明，在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72h后，用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度，用WB檢測(cè)HIF-2α蛋白表達(dá)水平，以篩選抑制效果最佳的shRNA-HIF-2α質(zhì)粒。
　　4.低氧下肝癌細(xì)胞HIF-2α和SCD1的調(diào)控關(guān)系：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取12h為SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)；參照前期研究，用10μM SCD1小分子抑

7、制劑CAY10566處理肝癌細(xì)胞24h。分為以下幾組：空白組（無(wú)任何處理）、低氧組（1%O212h）、低氧陰性對(duì)照組（HIF-2α陰性質(zhì)粒+1%O212h）、低氧干擾組（HIF-2α干擾質(zhì)粒+1%O212h）、低氧CAY組（CAY1056610μM+1%O212h）、低氧干擾+CAY組（HIF-2α干擾質(zhì)粒+CAY1056610μM+1%O212 h）， WB檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞HIF-2α及SCD1蛋白表達(dá)變化。
　　二、低氧下HI

8、F-2α—SCD1通路對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：
　　CCK8技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/PE法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　一、低氧誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞細(xì)胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關(guān)系
　　1、低氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞 HIF-2α和SCD1蛋白表達(dá)時(shí)間譜：隨著低氧誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)（0h、3h、6h、12h、24h），He

9、pG2和SMMC-7721細(xì)胞HIF-2α和SCD1蛋白表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增加(P＜0.05)。其中，SMMC-7721細(xì)胞于低氧刺激12h時(shí)，HIF-2α蛋白表達(dá)水平升高至平臺(tái)期。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以12h為SMMC-7721和HepG2細(xì)胞的最佳低氧誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)。
　　2、篩選shRNA-HIF-2α質(zhì)粒：在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞72h后，各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率達(dá)90%左右；WB結(jié)果顯示，與空白對(duì)比，shRNA-HIF-2α C質(zhì)粒抑制肝癌細(xì)胞HI

10、F-2α蛋白表達(dá)的效果最佳（P＜0.05）。
　　3、低氧下肝癌細(xì)胞HIF-2α和SCD1之間的調(diào)控關(guān)系：WB結(jié)果顯示，低氧環(huán)境下抑制HIF-2α表達(dá)后，兩種肝癌細(xì)胞表達(dá)SCD1蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）；而抑制SCD1表達(dá)，對(duì)肝癌細(xì)胞HIF-2α蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05）；同時(shí)抑制HIF-2α和SCD1表達(dá)，肝癌細(xì)胞表達(dá)SCD1蛋白減少程度較單獨(dú)抑制HIF-2α或SCD1的更為明顯（P＜0.05）。提示低氧條件下

11、HIF-2α對(duì)肝癌細(xì)胞SCD1的表達(dá)具有一定調(diào)控作用。
　　二、低氧下HIF-2α—SCD1通路對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　1、CCK8檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖情況：與空白組比較，低氧組、低氧陰性組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05）；低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達(dá)，HepG2、SMMC-7721細(xì)胞增殖率較低氧組明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)抑制HIF-2α和SCD1

12、表達(dá)，兩種肝癌細(xì)胞增殖率較低氧組、低氧干擾組及低氧CAY組均明顯減少（P＜0.05）。低氧組與低氧陰性對(duì)照組差異不具顯著性（P＞0.05）。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/PE法檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡改變：與空白組比較，HepG2、SMMC-7721細(xì)胞低氧組及低氧陰性對(duì)照細(xì)胞凋亡率減少；低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達(dá)，HepG2、SMMC-7721細(xì)胞凋亡率較低氧組和低氧陰性對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）；同時(shí)抑制H

13、IF-2α和SCD1表達(dá)，兩種肝癌細(xì)胞凋亡率較低氧組、低氧干擾組及低氧 CAY組均明顯增多（P＜0.05）。低氧組與低氧陰性對(duì)照組差異不具顯著性（P＞0.05）。
　　3、Transwell檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲改變：與空白組比較，低氧組和低氧陰性對(duì)照組HepG2和SMMC-7721細(xì)胞侵襲指數(shù)提高。低氧環(huán)境下抑制HIF-2α或SCD1表達(dá)，HepG2、SMMC-7721細(xì)胞侵襲指數(shù)較低氧組明顯降低（P＜0.05）；同時(shí)抑制HIF-2α