轉(zhuǎn)錄因子Glil在乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為中的作用及可能機制究.pdf

1、乳腺癌的發(fā)病率在所有女性腫瘤中占首位，達22.9％，并且乳腺癌的致死率也在女性癌癥中排名第一。近年來乳腺癌在中國婦女中的發(fā)病率正悄然上升，在過去的十年間，北京、上海乳腺癌的發(fā)病率上升分別超過20％及30％，已接近西方乳腺癌高發(fā)國家的水平，因此加強對乳腺癌發(fā)生與發(fā)展的機制研究已刻不容緩。
　　 Hedghog(Hh)/Gli信號通路是一條經(jīng)典的胚胎發(fā)育信號系統(tǒng)，在胚胎發(fā)育和胚胎形成后細(xì)胞的生長和分化過程中都起著重要作用。轉(zhuǎn)錄因子G

2、li1既是Hh通路下游的效應(yīng)分子，也是該通路調(diào)節(jié)的靶蛋白，其表達也是Hh/Gli信號通路激活的標(biāo)志。盡管已有研究表明，Hh/Gli通路參與了乳腺的正常發(fā)育，且與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。例如，Gli1及其他Hh通路成員在乳腺癌組織中常見異常表達；Gli1的高表達可以促進乳腺癌細(xì)胞的增殖，并能抑制雌激素受體(estrogenreceptora，ERa)的表達。但是Gli1對乳腺癌其他生物學(xué)行為的影響還不很清楚，對其作用的機制也缺乏深入的

3、研究。加之乳腺癌是一種包含多種類型的不均一性疾病。除了不同的病理類型外，還可根據(jù)癌細(xì)胞雌激素受體(ER)的表達情況，分為雌激素依賴型(ER陽性)和非依賴型(ER陰性)乳腺癌兩大類型。不同類型乳腺癌之間具有明顯不同的生物學(xué)特性和臨床表現(xiàn)。Hedghog(Hh)/Gli信號通路對這兩種不同乳腺癌的增殖、分化、遷移等是否有不同的影響也不清楚。
　　 MCF-7和T47D細(xì)胞是ER陽性的雌激素依賴性細(xì)胞系，其分化程度相對比較高，而增殖和

4、侵襲能力都比雌激素非依賴性乳腺癌細(xì)胞，如MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞低。本校病理生理教研室在前期研究中發(fā)現(xiàn)Gli1在MCF-7和T47D中的表達明顯低于MDA-MB-231和SK-BR-3，并顯示Gli1的表達水平與ER的表達呈負(fù)相關(guān)，與乳腺癌的增殖呈正相關(guān)。本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，擬進一步研究Gli1在乳腺癌增殖、粘附、遷移、抗凋亡等生物學(xué)行為中的作用及可能機制。我們首先建立了持續(xù)性穩(wěn)定高表達Gli1的MCF-7、T47

5、D細(xì)胞系，觀察高表達Gli1對乳腺癌細(xì)胞粘附、遷移、抗凋亡等生物學(xué)特性的影響，繼而通過全基因組寡核苷酸微陣列芯片分析，尋找轉(zhuǎn)染Gli1表達質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的MCF-7細(xì)胞之間的差異表達基因，分析受Gli1調(diào)控的基因在乳腺癌生物學(xué)行為中的作用，并預(yù)測乳腺癌細(xì)胞中Gli1的靶基因，探討Gli1影響乳腺癌生物學(xué)特性的可能機制，進一步研究Gli1在乳腺痛發(fā)生發(fā)展中作用，尋找乳腺癌的治療的可能靶點。
　　 為研究Gli1

6、在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，全文由以下三個部分組成：
　　 第一部分，穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達Gli1對乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、粘附和凋亡的影響
　　 目的：探討Gli1在乳腺癌細(xì)胞增殖、粘附、遷移、凋亡等生物學(xué)行為中的作用。
　　 方法：采用細(xì)胞增殖實驗、粘附實驗、Transwell遷移實驗等，與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的對照細(xì)胞相比，觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染高表達Gli1對乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞株增殖、粘附、遷移的影響。給予紫杉醇(pacl

7、itaxel，PTX)100nM處理24小時、48小時，采用CCK-8法檢測高表達Gli1對PTX凋亡誘導(dǎo)下細(xì)胞存活率的影響。
　　 結(jié)果：成功建立穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達Gli1的MCF-7、T47D細(xì)胞株及穩(wěn)轉(zhuǎn)空載質(zhì)粒的對照細(xì)胞。穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達Gli1促進乳腺癌細(xì)胞增殖，并能明顯促進細(xì)胞的粘附；其中穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達Gli1的MCF-7、T47D細(xì)胞粘附能力分別是對照細(xì)胞的1.58、1.41倍(p<0.05)；Transwell小室遷移實驗中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)轉(zhuǎn)

8、高表達Gli1的MCF-7細(xì)胞組遷移的細(xì)胞數(shù)為對照的31.6％(p<0.05)。紫杉醇處理細(xì)胞24h、48h，各個時間點高表達Gli1細(xì)胞組細(xì)胞的存活率均高于對照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：高表達Gli1能促進乳腺癌細(xì)胞MCF-7、T47D的增殖、粘附，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移，促進其在凋亡誘導(dǎo)劑PTX作用下的存活。
　　 第二部分，Glil調(diào)控的靶基因的篩選與鑒定
　　 目的：篩選Gli1調(diào)控的基因

9、，探討Gli1對乳腺癌生物學(xué)行為影響的可能機制，尋找Gli1的靶基因。
　　 方法：采用人全基因組寡核苷酸微陣列芯片技術(shù)，篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達Gli1的MCF-7與對照細(xì)胞之間的差異表達基因，并用QRT-PCR方法驗證。生物信息學(xué)分析預(yù)測Gli1可能的靶基因，采用QRT-PCR方法檢測重組人Hedgehog通路配體SHH-N(recombinanthumanSHHN-turminus，rhSHH-N)處理MCF-7細(xì)胞4小時后GLI1

10、、CCL2、BIRC3mRNA的變化，推測其是否為Gli1的直接靶基因。
　　 結(jié)果：基因芯片共篩選出Gli1-MCF-7與對照細(xì)胞差異表達基因338個，其中表達上調(diào)的基因有179個，表達下調(diào)的基因有159個，隨機挑選部分基因，采用QRT-PCR方法驗證，其mRNA表達情況與基因芯片結(jié)果一致。信號通路分析提示，這些基因編碼的蛋白功能涉及細(xì)胞增殖、凋亡、粘附、趨化、炎癥反應(yīng)、泛素化、代謝等各方面，其中，BTG1、SESN1、CLD

11、N2、BIRC3、CCL2等改變基因可能是Gli1影響乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機制之一。經(jīng)分析，潛在靶基因BIRC3、CCL2基因的啟動子區(qū)域有Gli1的結(jié)合序列。用rhSHH-N蛋白處理MCF-7細(xì)胞4小時，觀察到BIRC3、CCL2的mRNA表達的增加，推測BIRC3、CCL2可能為GLI1的靶基因。
　　 結(jié)論：Gli1調(diào)控的基因涉及粘附、凋亡、轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)等方面，這些被調(diào)控的基因參與了Gli1對乳腺癌各種生物學(xué)行為的作用

12、。其中BIRC3、CCL2可能為Gli1的直接靶基因。
　　 第三部分，影響乳腺癌細(xì)胞Gli1表達的因素
　　 目的：基于雌激素(17β-estradiol，E2)對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要作用，觀察雌激素、雌激素受體ERQ對Gli1表達、轉(zhuǎn)錄活性的影響。并觀察血清濃度對Gli1表達的影響。
　　 方法：乳腺癌MCF-7細(xì)胞給予E2處理不同時間，采用QRT-PCR、WesternBlot方法分別檢測Gli1的mRNA

13、、蛋白的表達。MCF-7中采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染ERa，熒光素酶報告基因方法檢測Gli1轉(zhuǎn)錄活性的改變。分別用含10％、5％、2.5％、0.5％的去激素血清培養(yǎng)液培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞24h，QRT-PCR方法檢測Gli1mRNA表達的改變。
　　 結(jié)果：雌激素E2能時間依賴性地上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Gli1的表達，36h時mRNA表達最高，為對照的4.36倍，各時間點Gli1mRNA表達量與對照相比均有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05)；瞬